Padrões de Resposta Intestinal a Sinais Microbianos

Apenas adultos > 18 anos serão incluídos. Duas coortes serão incluídas: Uma coorte de pacientes com DC (incluindo subcoortes específicas de DC recrutados e de início recente e pacientes com DC itinerantes e amostras patológicas arquivadas de DC pós-operatória, total n = 300) e uma coorte de controles (indivíduos saudáveis ​​e familiares de pacientes com DC, total n=200). Obteremos amostras de fezes e sangue e biópsia intestinal e/ou espécimes de ressecção de pacientes com DC, e amostras de sangue, fezes e biópsia intestinal de indivíduos saudáveis ​​e parentes assintomáticos da família submetidos à colonoscopia por motivos não relacionados ao estudo (por exemplo, colonoscopia de triagem ).

Após a assinatura do consentimento informado, será obtida uma amostra de fezes e uma amostra de sangue (20cc). Infecções entéricas serão excluídas por culturas de fezes, parasitas incluindo entameba e ensaio de C. difficile. Marcadores inflamatórios (PCR no sangue, calprotectina nas fezes) serão testados. As amostras de sangue serão submetidas à caracterização imunológica, incluindo testes in vitro por ativação de células imunes, medições de secreção de citocinas e análise de marcadores de superfície celular por FACS. Duas amostras fecais por doador, (≥3g ou 3 mL cada) serão coletadas em recipientes limpos à temperatura ambiente, congeladas a -20°C e armazenadas a -80°C em 72h. Também obteremos na colonoscopia quatro biópsias de mucosa ileal e colônica inflamada e não inflamada (total de 8 biópsias). De cada indivíduo, as amostras serão divididas para análises no Sheba e para transferência. As fezes serão transferidas para o Prof. Elinav no Weizmann Institute para realizar metagenômica shotgun do microbioma. Biópsia intestinal e/ou espécimes de ressecção arquivados (histologia) serão transferidos para o Prof Stappenbeck na Universidade de Washington, St. Louis EUA, para análise histológica de células imunes inatas e análise de morfologia de células paneth por H&E e imuno-histoquímica.

As biópsias ileal e retal serão coletadas e armazenadas imediatamente em RNAlater. As biópsias serão obtidas de cada local (inflamado ou não inflamado, totalizando 8 biópsias) e usadas para RNA e para extração de DNA microbiano. O RNA será utilizado para mRNAseq de tecido, e o DNA para caracterização microbiana. O mRNAseq será feito no núcleo do centro de saúde digestiva (DHC) apoiado pelo NIH no Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC), onde mais de 700 mRNAseq de diferentes coortes de IBD, incluindo coortes RISK CD e PROTECT UC, já foram executados com bons resultados. O sequenciamento de amplicon 16S microbiano de fezes e DNA extraído por biópsia será feito conforme descrito anteriormente.

Os pacientes de ambas as coortes também serão submetidos a pesquisa de exposição ambiental e alimentar. Para a exposição ambiental, utilizaremos o questionário desenvolvido pela Organização Internacional das DII (IOIBD), com algumas modificações. O questionário é composto por 87 questões abrangendo 25 tópicos diferentes propostos como fatores de risco ambiental para DC e/ou UC. Este questionário foi usado anteriormente em estudos epidemiológicos que investigam os gatilhos da DII, incluindo um conduzido no Sudeste Asiático e na China. As perguntas dizem respeito a cinco áreas diferentes principais: (i) Fatores da infância até 20 anos, incluindo amamentação, apendicectomia, amigdalectomia, eczema, vacinas (tuberculose, coqueluche, sarampo, rubéola, difteria, tétano, poliomielite), infecções infantis (sarampo, coqueluche , rubéola, varicela, caxumba, escarlatina) e posse de animais de estimação; (ii) hábitos alimentares incluindo consumo diário, semanal ou menos frequente de fruta, legumes, ovo, cereais, pão, cereais, café, chá, sumo, açúcar e fast food; (iii) hábitos tabágicos (fumante atual, não fumante, ex-fumante); (iv) condições sanitárias, como a disponibilidade de torneira de água interna, torneira de água quente ou vaso sanitário com descarga; e (v) outros fatores incluindo atividade física diária, pílula anticoncepcional oral e eventos estressantes antes do diagnóstico. Também adicionaremos ao questionário IOIBD itens referentes ao uso de antibióticos antes e depois dos 15 anos de idade, uso de creme dental e presença de obturação de amálgama durante a infância ou mais tarde na vida.

Para o mapeamento dos hábitos alimentares utilizaremos uma entrevista realizada por um nutricionista treinado e utilizando o QFA (Questionário de Frequência Alimentar) estruturado e validado. Esta ferramenta captura mais de 600 itens alimentares, priorizados por sua frequência pré-definida na dieta regular. O pessoal será treinado no método de entrevista dietética. Os resultados do FFQ serão posteriormente importados para a versão computadorizada do FFQ, que automaticamente deriva e normaliza o conteúdo de nutrientes de uma dieta de paciente individual com base no banco de dados de nutrientes de alimentos de Israel conhecidos do Instituto Nacional de Estatística. Conforme mostrado na figura da captura de tela deste software responsivo para um paciente exemplar, cada barra colorida denota um consumo específico de nutrientes pelo indivíduo (por exemplo, proteína, oligossacarídeos, etc.), juntamente com sua divergência do consumo normalizado pela OMS (intervalo de cor verde) . A metodologia QFA será complementada por uma validação prospectiva do itinerário alimentar de três dias capturada por SmartPhone. Os participantes tirarão fotos eletrônicas de todos os alimentos consumidos durante esses três dias. As fotos serão carregadas em um banco de dados visual eletrônico e os alimentos serão identificados, registrados e verificados em relação ao FFQ retrospectivo.

A fim de priorizar entre os múltiplos fatores ambientais/alimentares, realizaremos uma revisão sistemática e meta-análise de todas as publicações pertencentes aos fatores de risco ambientais para DC. Calcularemos o odds ratio agrupado e estimaremos pontos para cada variável e definiremos os efeitos ponderados entre as variáveis ​​usando o modelo de efeito aleatório. Isso permitirá dissecar e identificar os fatores que foram mais reprodutíveis e robustos associados à ocorrência de DC. Em seguida, priorizaremos essas variáveis ​​de maneira gradual, para a análise da associação de fatores ambientais com microbioma, transcriptoma e perturbações do PCP.