Darmreaktionsmuster auf mikrobielle Signale

Nur Erwachsene > 18 Jahre werden eingeschlossen. Zwei Kohorten werden eingeschlossen: Eine Kohorte von CD-Patienten (einschließlich spezifischer Unterkohorten von rekrutierten Patienten mit bekannter und neu aufgetretener CD und reisenden CD-Patienten und archivierten pathologischen Proben von postoperativer CD, insgesamt n = 300) und einer Kontrollkohorte (gesunde Personen und Familienmitglieder von MC-Patienten, insgesamt n=200). Wir werden Stuhl- und Blutproben sowie Darmbiopsien und/oder Resektionsproben von CD-Patienten sowie Blut-, Stuhl- und Darmbiopsieproben von gesunden Personen und asymptomatischen Familienangehörigen erhalten, die sich aus Gründen, die nicht mit der Studie in Zusammenhang stehen, einer Koloskopie unterziehen (z. B. Screening-Koloskopie ).

Nach Unterzeichnung der Einverständniserklärung werden eine Stuhlprobe und eine Blutprobe (20 cc) entnommen. Darminfektionen werden durch Stuhlkulturen, Parasiten einschließlich Entameba und C. difficile-Assay ausgeschlossen. Entzündungsmarker (CRP im Blut, Calprotectin im Stuhl) werden getestet. Blutproben werden einer Immuncharakterisierung unterzogen, einschließlich In-vitro-Tests durch Immunzellaktivierung, Zytokinsekretionsmessungen und Zelloberflächenmarkeranalyse durch FACS. Zwei Stuhlproben pro Spender (jeweils ≥ 3 g oder 3 ml) werden in sauberen Behältern bei Raumtemperatur gesammelt, bei -20 °C frisch eingefroren und dann innerhalb von 72 Stunden bei -80 °C gelagert. Wir werden auch bei der Koloskopie vier Biopsien von entzündeter und nicht entzündeter Schleimhaut des Ileums und des Dickdarms (insgesamt 8 Biopsien) erhalten. Von jeder Person werden Proben für Analysen bei Sheba und für den Transfer geteilt. Der Stuhl wird an Prof. Elinav vom Weizmann-Institut übergeben, um eine Shotgun-Metagenomik des Mikrobioms durchzuführen. Darmbiopsien und/oder archivierte Resektionsproben (Histologie) werden an Prof. Stappenbeck an der Washington University, St. Louis, USA, zur histologischen Analyse der angeborenen Immunzellen und zur Analyse der Panethzellmorphologie durch H&E und Immunhistochemie übertragen.

Ileum- und Rektalbiopsien werden gesammelt und sofort in RNAlater gespeichert. Biopsien werden von jedem Ort (entweder entzündet oder nicht entzündet, insgesamt 8 Biopsien) entnommen und für die RNA- und mikrobielle DNA-Extraktion verwendet. RNA wird für die mRNAseq von Gewebe und DNA für die mikrobielle Charakterisierung verwendet. mRNAseq wird im Kern des NIH-unterstützten Verdauungsgesundheitszentrums (DHC) des Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC) durchgeführt, wo >700 mRNAseq verschiedener IBD-Kohorten, einschließlich RISK CD- und PROTECT UC-Kohorten, bereits mit guten Ergebnissen durchgeführt wurden. Die mikrobielle 16S-Amplikon-Sequenzierung von Stuhl- und Biopsie-extrahierter DNA wird wie zuvor beschrieben durchgeführt.

Patienten aus beiden Kohorten werden auch einer Umwelt- und Ernährungsumfrage unterzogen. Für die Umweltexposition verwenden wir den Fragebogen, der von der International Organization of IBD (IOIBD) entwickelt wurde, mit einigen Modifikationen. Der Fragebogen besteht aus 87 Fragen, die 25 verschiedene Themen abdecken, die als umweltbedingte Risikofaktoren für Zöliakie und/oder CU vorgeschlagen werden. Dieser Fragebogen wurde zuvor in epidemiologischen Studien verwendet, die die Auslöser von CED untersuchten, einschließlich einer Studie, die in Südostasien und China durchgeführt wurde. Die Fragen beziehen sich auf fünf verschiedene Hauptbereiche: (i) Kindheitsfaktoren bis zu 20 Jahren einschließlich Stillen, Appendektomie, Tonsillektomie, Ekzem, Impfungen (Tuberkulose, Keuchhusten, Masern, Röteln, Diphtherie, Tetanus, Polio), Kinderinfektionen (Masern, Keuchhusten). , Röteln, Windpocken, Mumps, Scharlach) und Haustierhaltung; (ii) Ernährungsgewohnheiten einschließlich des täglichen, wöchentlichen oder weniger häufigen Verzehrs von Obst, Gemüse, Ei, Müsli, Brot, Cerealien, Kaffee, Tee, Saft, Zucker und Fast Food; (iii) Rauchgewohnheiten (aktueller Raucher, Nichtraucher, Ex-Raucher); (iv) sanitäre Bedingungen wie die Verfügbarkeit eines hausinternen Wasserhahns, Warmwasserhahns oder einer Toilette mit Spülung; und (v) andere Faktoren, einschließlich täglicher körperlicher Aktivität, oraler Kontrazeptiva und Stressereignisse vor der Diagnose. Wir werden den IOIBD-Fragebogen auch um Punkte ergänzen, die sich auf die Verwendung von Antibiotika vor und nach dem 15. Lebensjahr, die Verwendung von Zahnpasta und das Vorhandensein von Amalgam-Zahnfüllungen in der Kindheit oder im späteren Leben beziehen.

Zur Erfassung der Ernährungsgewohnheiten verwenden wir ein Interview, das von einem ausgebildeten Ernährungsberater durchgeführt wird und den validierten strukturierten FFQ (Food Frequency Questionnaire) verwendet. Dieses Tool erfasst >600 Lebensmittel, priorisiert nach ihrer vordefinierten Häufigkeit in der normalen Ernährung. Das Personal wird in der Methode der Ernährungsinterviews geschult. Die FFQ-Ergebnisse werden weiter in die computerisierte FFQ-Version importiert, die automatisch den Nährstoffgehalt aus der Ernährung eines einzelnen Patienten basierend auf der bekannten israelischen Nährstoffdatenbank des National Institute of Statistics ableitet und normalisiert. Wie in der Screenshot-Abbildung dieser reaktionsschnellen Software für einen beispielhaften Patienten gezeigt, zeigt jeder Farbbalken einen spezifischen Nährstoffverbrauch des Individuums (z. B. Protein, Oligosaccharide usw.) zusammen mit seiner Abweichung vom normalisierten WHO-Verbrauch (grüner Bereich). . Die FFQ-Methodik wird durch eine Validierung prospektiver dreitägiger Ernährungsroutenerfassung per SmartPhone ergänzt. Die Teilnehmer machen elektronische Fotos von allen Lebensmitteln, die während dieser drei Tage verzehrt werden. Fotos werden in die elektronische visuelle Datenbank hochgeladen, und Lebensmittel werden identifiziert, aufgezeichnet und anhand des retrospektiven FFQ verifiziert.

Um unter den zahlreichen Umwelt-/Ernährungsfaktoren Prioritäten zu setzen, werden wir eine systematische Überprüfung und Metaanalyse aller Veröffentlichungen durchführen, die sich auf Umweltrisikofaktoren für Zöliakie beziehen. Wir berechnen das gepoolte Quotenverhältnis und Punktschätzungen für jede Variable und definieren die gewichteten Effekte zwischen den Variablen unter Verwendung des Random-Effect-Modells. Dies wird es ermöglichen, Faktoren zu sezieren und zu identifizieren, die am reproduzierbarsten und zuverlässigsten mit dem Auftreten von Zöliakie assoziiert sind. Wir werden diese Variablen dann schrittweise priorisieren, um die Assoziation von Umweltfaktoren mit Mikrobiom-, Transkriptom- und PCP-Störungen zu analysieren.