Wzorce odpowiedzi jelit na sygnały drobnoustrojów

Uwzględnieni zostaną tylko dorośli w wieku powyżej 18 lat. Uwzględnione zostaną dwie kohorty: Kohorta pacjentów z CD (w tym określone podkohorty zwerbowanych pacjentów z rozpoznaną i nowo rozpoznaną CD oraz podróżujących pacjentów z CD oraz zarchiwizowane próbki patologiczne pooperacyjnej postaci CD, łącznie n= 300) oraz kohortę kontrolną (osoby zdrowe i członkowie rodzin pacjentów z CD, łącznie n=200). Pobierzemy próbki kału i krwi oraz próbki biopsji jelit i/lub resekcji od pacjentów z CD, a także próbki krwi, kału i biopsji jelit od osób zdrowych i bezobjawowych krewnych rodzin poddawanych kolonoskopii z przyczyn niezwiązanych z badaniem (np. kolonoskopia przesiewowa ).

Po podpisaniu świadomej zgody zostanie pobrana próbka kału i próbka krwi (20 ml). Infekcje jelitowe zostaną wykluczone przez posiewy kału, pasożyty, w tym entameba, i test C. difficile. Zostaną zbadane markery stanu zapalnego (CRP we krwi, kalprotektyna w kale). Próbki krwi zostaną poddane charakteryzacji immunologicznej, w tym testom in vitro poprzez aktywację komórek odpornościowych, pomiarom wydzielania cytokin i analizie markerów powierzchniowych komórek metodą FACS. Dwie próbki kału od dawcy (≥3 g lub 3 ml każda) zostaną pobrane do czystych pojemników w temperaturze pokojowej, świeżo zamrożone w temperaturze -20°C, a następnie przechowywane w temperaturze -80°C w ciągu 72 godzin. Podczas kolonoskopii uzyskamy również cztery biopsje z zapalnej i niezapalnej błony śluzowej jelita krętego i okrężnicy (łącznie 8 biopsji). Od każdego osobnika zostaną pobrane próbki do analiz w Sheba i do przeniesienia. Kał zostanie przekazany prof. Elinav w Instytucie Weizmanna w celu przeprowadzenia metagenomiki mikrobiomu typu shotgun. Biopsja jelita i/lub zarchiwizowane próbki resekcji (histologia) zostaną przesłane do prof. Stappenbecka z Washington University, St. Louis, USA, w celu przeprowadzenia analizy histologicznej wrodzonych komórek odpornościowych i analizy morfologii komórek Panetha za pomocą H&E i immunohistochemii.

Biopsje jelita krętego i odbytnicy będą pobierane i przechowywane natychmiast w RNAlater. Biopsje zostaną pobrane z każdego miejsca (w stanie zapalnym lub bez, w sumie 8 biopsji) i wykorzystane do ekstrakcji RNA i DNA drobnoustrojów. RNA zostanie użyte do mRNAseq tkanki, a DNA do charakterystyki drobnoustrojów. mRNAseq zostanie wykonane we wspieranym przez NIH rdzeniu centrum zdrowia układu trawiennego (DHC) w Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC), gdzie przeprowadzono już ponad 700 mRNAseq różnych kohort IBD, w tym kohort RISK CD i PROTECT UC, z dobrymi wynikami. Sekwencjonowanie amplikonu 16S mikrobiologicznego kału i DNA wyekstrahowanego z biopsji zostanie przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem.

Pacjenci z obu kohort zostaną również poddani badaniu narażenia środowiskowego i dietetycznego. W przypadku narażenia środowiskowego użyjemy kwestionariusza opracowanego przez Międzynarodową Organizację IBD (IOIBD), z pewnymi modyfikacjami. Kwestionariusz składa się z 87 pytań obejmujących 25 różnych tematów proponowanych jako środowiskowe czynniki ryzyka CD i/lub UC. Kwestionariusz ten był wcześniej wykorzystywany w badaniach epidemiologicznych dotyczących czynników wyzwalających nieswoiste zapalenia jelit, w tym w jednym prowadzonym w Azji Południowo-Wschodniej i Chinach. Pytania dotyczą pięciu głównych różnych obszarów: (i) Czynniki wieku dziecięcego do 20 roku życia, w tym karmienie piersią, wycięcie wyrostka robaczkowego, wycięcie migdałków, egzema, szczepienia (gruźlica, krztusiec, odra, różyczka, błonica, tężec, polio), infekcje wieku dziecięcego (odra, krztusiec , różyczka, ospa wietrzna, świnka, szkarlatyna) i posiadanie zwierząt domowych; (ii) nawyki żywieniowe, w tym codzienne, cotygodniowe lub rzadsze spożywanie owoców, warzyw, jajek, płatków zbożowych, chleba, płatków śniadaniowych, kawy, herbaty, soków, cukru i fast foodów; (iii) nawyki związane z paleniem (aktualny palacz, niepalący, były palacz); (iv) warunki sanitarne, takie jak dostępność wewnętrznego kranu, kranu z ciepłą wodą lub spłukiwanej toalety; oraz (v) inne czynniki, w tym codzienna aktywność fizyczna, doustna pigułka antykoncepcyjna i stresujące wydarzenia przed postawieniem diagnozy. Uzupełnimy także kwestionariusz IOIBD o pozycje dotyczące stosowania antybiotyków przed i po 15 roku życia, stosowania pasty do zębów oraz obecności plomb amalgamatowych w dzieciństwie lub w późniejszym życiu.

Do mapowania nawyków żywieniowych wykorzystamy wywiad przeprowadzony przez przeszkolonego dietetyka przy użyciu zwalidowanego ustrukturyzowanego kwestionariusza FFQ (Food Frequency Questionnaire). To narzędzie wychwytuje ponad 600 artykułów żywnościowych, uszeregowanych pod względem ich predefiniowanej częstotliwości w zwykłej diecie. Personel zostanie przeszkolony z metody wywiadu dietetycznego. Wyniki FFQ zostaną następnie zaimportowane do skomputeryzowanej wersji FFQ, która automatycznie wyprowadza i normalizuje zawartość składników odżywczych z indywidualnej diety pacjenta na podstawie znanej izraelskiej bazy danych składników odżywczych z Narodowego Instytutu Statystycznego. Jak pokazano na zrzucie ekranu z tego responsywnego oprogramowania dla przykładowego pacjenta, każdy kolorowy pasek oznacza określone spożycie składników odżywczych przez daną osobę (np. białka, oligosacharydy itp.) . Metodologia FFQ zostanie uzupełniona o walidację prospektywnego trzydniowego planu żywieniowego przechwyconego przez SmartPhone. Uczestnicy będą robić elektroniczne zdjęcia wszystkich produktów spożywczych spożywanych w ciągu tych trzech dni. Zdjęcia zostaną przesłane do elektronicznej wizualnej bazy danych, a produkty żywnościowe zostaną zidentyfikowane, zarejestrowane i zweryfikowane z retrospektywnym FFQ.

Aby ustalić priorytety wśród wielu czynników środowiskowych/dietetycznych, przeprowadzimy systematyczny przegląd i metaanalizę wszystkich publikacji dotyczących środowiskowych czynników ryzyka CD. Obliczymy połączone iloraz szans i szacunki punktowe dla każdej zmiennej oraz zdefiniujemy ważone efekty między zmiennymi za pomocą modelu efektów losowych. Umożliwi to przeanalizowanie i zidentyfikowanie czynników, które w najbardziej powtarzalny i solidny sposób zostały uznane za związane z występowaniem CD. Następnie stopniowo uszeregujemy te zmienne w celu analizy związku czynników środowiskowych z perturbacjami mikrobiomu, transkryptomu i PCP.