Modelli di risposta intestinale ai segnali microbici

Saranno inclusi solo adulti > 18 anni, saranno incluse due coorti: una coorte di pazienti affetti da celiachia (comprese sottocoorti specifiche di pazienti reclutati con celiachia nota e di nuova insorgenza e pazienti con celiachia in viaggio e campioni patologici archiviati di celiachia postoperatoria, totale n= 300) e una coorte di controlli (individui sani e familiari di pazienti CD, totale n=200). Otterremo campioni di sangue e feci e biopsia intestinale e/o campioni di resezione da pazienti CD e campioni di sangue, feci e biopsia intestinale da individui sani e parenti asintomatici sottoposti a colonscopia per motivi non correlati allo studio (ad es. colonscopia di screening ).

Dopo aver firmato il consenso informato, verranno prelevati campioni di feci e campioni di sangue (20 cc). Le infezioni enteriche saranno escluse dalle colture fecali, dai parassiti inclusa l'entameba e dal dosaggio di C. difficile. Verranno testati marcatori infiammatori (CRP nel sangue, calprotectina nelle feci). I campioni di sangue saranno sottoposti a caratterizzazione immunitaria, inclusi test in vitro mediante attivazione delle cellule immunitarie, misurazioni della secrezione di citochine e analisi dei marcatori di superficie cellulare mediante FACS. Due campioni fecali per donatore (≥3g o 3 ml ciascuno) saranno raccolti in contenitori puliti a temperatura ambiente, freschi congelati a -20°C e quindi conservati a -80°C entro 72 ore. Otterremo anche alla colonscopia quattro biopsie da mucosa ileale e colica infiammata e non infiammata (totale 8 biopsie). Da ogni individuo, i campioni saranno divisi per le analisi a Sheba e per il trasferimento. Le feci saranno trasferite al Prof. Elinav dell'Istituto Weizmann per eseguire la metagenomica del microbioma. La biopsia intestinale e/oi campioni di resezione archiviati (istologia) saranno trasferiti al Prof Stappenbeck presso la Washington University, St. Louis USA, per l'analisi istologica delle cellule immunitarie innate e l'analisi della morfologia delle cellule paneth mediante H&E e immunoistochimica.

Le biopsie ileali e rettali saranno raccolte e conservate immediatamente in RNA successivamente. Le biopsie saranno ottenute da ciascuna sede (infiammata o non infiammata, totale 8 biopsie) e utilizzate per l'estrazione dell'RNA e del DNA microbico. L'RNA sarà utilizzato per l'mRNAseq del tessuto e il DNA per la caratterizzazione microbica. mRNAseq sarà eseguito presso il nucleo del centro di salute digestiva (DHC) supportato dal NIH presso il Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC), dove sono già stati eseguiti con buoni risultati> 700 mRNAseq di diverse coorti IBD, comprese le coorti RISK CD e PROTECT UC. Il sequenziamento dell'amplicone microbico 16S del DNA estratto da feci e biopsia sarà eseguito come descritto in precedenza.

I pazienti di entrambe le coorti saranno inoltre sottoposti a un'indagine sull'esposizione ambientale e alimentare. Per l'esposizione ambientale, utilizzeremo il questionario sviluppato dall'Organizzazione internazionale dell'IBD (IOIBD), con alcune modifiche. Il questionario è composto da 87 domande che coprono 25 diversi argomenti proposti come fattori di rischio ambientale per MC e/o CU. Questo questionario è stato precedentemente utilizzato in studi epidemiologici che indagavano sui trigger di IBD, compreso uno condotto nel sud-est asiatico e in Cina. Le domande riguardano cinque aree principali: (i) Fattori dell'infanzia fino a 20 anni inclusi allattamento al seno, appendicectomia, tonsillectomia, eczema, vaccinazioni (tubercolosi, pertosse, morbillo, rosolia, difterite, tetano, poliomielite), infezioni infantili (morbillo, pertosse , rosolia, varicella, parotite, scarlattina) e possesso di animali domestici; (ii) abitudini alimentari compreso il consumo giornaliero, settimanale o meno frequente di frutta, verdura, uova, cereali, pane, cereali, caffè, tè, succhi, zucchero e fast food; (iii) abitudine al fumo (fumatore attuale, non fumatore, ex fumatore); (iv) condizioni igieniche come la disponibilità di un rubinetto interno dell'acqua, di un rubinetto dell'acqua calda o di servizi igienici con sciacquone; e (v) altri fattori tra cui attività fisica quotidiana, pillola contraccettiva orale ed eventi stressanti prima della diagnosi. Aggiungeremo anche al questionario IOIBD voci relative all'uso di antibiotici prima e dopo i 15 anni, l'uso di dentifrici e la presenza di otturazioni dentali in amalgama durante l'infanzia o più tardi nella vita.

Per la mappatura delle abitudini alimentari utilizzeremo un'intervista condotta da un dietologo qualificato e utilizzando il FFQ strutturato convalidato (Food frequency Questionnaire). Questo strumento acquisisce più di 600 alimenti, ordinati in base alla loro frequenza predefinita nella dieta regolare. Il personale sarà formato al metodo del colloquio dietetico. I risultati di FFQ saranno ulteriormente importati nella versione computerizzata di FFQ, che deriva automaticamente e normalizza il contenuto di nutrienti da una dieta individuale del paziente basata sul database di nutrienti di prodotti alimentari israeliani noti dall'Istituto Nazionale di Statistica. Come mostrato nella figura dello screenshot di questo software reattivo per un paziente esemplare, ogni barra di colore indica un consumo specifico di nutrienti da parte dell'individuo (ad es. Proteine, oligosaccaridi, ecc.), Insieme alla sua divergenza dal consumo normalizzato dell'OMS (intervallo di colore verde) . La metodologia FFQ sarà integrata da un itinerario dietetico prospettico di tre giorni di convalida catturato da SmartPhone. I partecipanti scatteranno foto elettroniche di tutti gli alimenti consumati durante questi tre giorni. Le foto verranno caricate in un database visivo elettronico e gli alimenti saranno identificati, registrati e verificati rispetto all'FFQ retrospettivo.

Al fine di stabilire la priorità tra i molteplici fattori ambientali/dietetici, eseguiremo una revisione sistematica e una meta-analisi di tutte le pubblicazioni relative ai fattori di rischio ambientale per CD. Calcoleremo gli odds ratio raggruppati e le stime puntuali per ciascuna variabile e definiremo gli effetti ponderati tra le variabili utilizzando il modello a effetti casuali. Ciò consentirà di sezionare e identificare i fattori che sono stati trovati in modo più riproducibile e robusto per essere associati all'insorgenza di CD. Daremo quindi la priorità a queste variabili in modo graduale, per l'analisi dell'associazione dei fattori ambientali con le perturbazioni del microbioma, del trascrittoma e del PCP.