Vzorce střevní odezvy na mikrobiální signály

Budou zahrnuti pouze dospělí >18 let. Budou zahrnuty dvě kohorty: Kohorta pacientů s CD (včetně specifických podkohor přijatých pacientů se známým a nově vzniklým CD a cestujících s CD a archivovaných patologických vzorků pooperačních CD, celkem n= 300) a kohorta kontrol (zdraví jedinci a rodinní příslušníci pacientů s CD, celkem n=200). Budeme získávat vzorky stolice a krve a vzorky střevní biopsie a/nebo resekce od pacientů s CD a vzorky krve, stolice a střevní biopsie od zdravých jedinců a asymptomatických rodinných příbuzných podstupujících kolonoskopii z důvodů nesouvisejících se studií (např. ).

Po podepsání informovaného souhlasu bude odebrán vzorek stolice a vzorek krve (20cc). Enterální infekce budou vyloučeny kultivací stolice, parazity včetně entameby a testem C. difficile. Budou testovány zánětlivé markery (CRP v krvi, kalprotektin ve stolici). Vzorky krve budou podrobeny imunitní charakterizaci včetně in vitro testování aktivací imunitních buněk, měřením sekrece cytokinů a analýzou markerů buněčného povrchu pomocí FACS. Dva vzorky stolice od dárce (≥3 g nebo 3 ml každý) budou odebrány do čistých nádob při pokojové teplotě, čerstvě zmrazené na -20 °C a poté uloženy při -80 °C do 72 hodin. Při kolonoskopii také získáme čtyři biopsie ze zanícené a nezanícené sliznice ilea a tlustého střeva (celkem 8 biopsií). Od každého jedince budou rozděleny vzorky pro analýzy v Shebě a pro přenos. Stolice bude převedena k prof. Elinavovi ve Weizmannově institutu, aby provedl brokovnicovou metagenomiku mikrobiomu. Střevní biopsie a/nebo archivované vzorky z resekce (histologie) budou předány prof. Stappenbeckovi na Washington University, St. Louis USA, k histologické analýze buněk vrozené imunity a analýze morfologie buněk paneth pomocí H&E a imunohistochemie.

Ileální a rektální biopsie budou odebrány a okamžitě uloženy v RNAlater. Z každého místa budou odebrány biopsie (buď zanícené nebo nezanícené, celkem 8 biopsií) a použity pro extrakci RNA a mikrobiální DNA. RNA bude použita pro mRNAseq tkáně a DNA pro mikrobiální charakterizaci. mRNAseq bude provedeno v jádru NIH podporovaného zažívacího zdravotního centra (DHC) v Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC), kde již proběhlo více než 700 mRNAseq různých IBD kohort včetně RISK CD a PROTECT UC kohort s dobrými výsledky. Sekvenování mikrobiálního 16S amplikonu DNA extrahované ze stolice a biopsie bude provedeno tak, jak bylo popsáno dříve.

Pacienti z obou kohort také podstoupí průzkum environmentální a dietní expozice. Pro expozici životního prostředí použijeme dotazník vyvinutý Mezinárodní organizací IBD (IOIBD) s určitou úpravou. Dotazník se skládá z 87 otázek pokrývajících 25 různých témat navržených jako environmentální rizikové faktory pro CD a/nebo UC. Tento dotazník byl již dříve používán v epidemiologických studiích zkoumajících spouštěče IBD, včetně studie provedené v jihovýchodní Asii a Číně. Otázky se týkají pěti hlavních různých oblastí: (i) Dětské faktory do 20 let včetně kojení, apendektomie, tonzilektomie, ekzém, očkování (tuberkulóza, černý kašel, spalničky, zarděnky, záškrt, tetanus, dětská obrna), dětské infekce (spalničky, černý kašel , zarděnky, plané neštovice, příušnice, spála) a vlastnictví domácích mazlíčků; ii) stravovací návyky včetně denní, týdenní nebo méně časté konzumace ovoce, zeleniny, vajec, obilovin, chleba, obilovin, kávy, čaje, džusu, cukru a rychlého občerstvení; iii) kuřácké návyky (současný kuřák, nekuřák, bývalý kuřák); iv) hygienické podmínky, jako je dostupnost vnitřního vodovodního kohoutku, kohoutku s teplou vodou nebo splachovacího záchodu; a (v) další faktory včetně každodenní fyzické aktivity, perorální antikoncepční pilulky a stresujících událostí před diagnózou. Do dotazníku IOIBD dále doplníme položky týkající se užívání antibiotik před a po 15. roce věku, používání zubní pasty a přítomnosti amalgámové výplně zubů v dětství nebo v pozdějším věku.

Pro zmapování stravovacích návyků využijeme pohovor vedený vyškoleným dietologem s využitím ověřeného strukturovaného dotazníku FFQ (Food frequency Questionnaire). Tento nástroj zachytí > 600 položek potravin, upřednostňovaných podle jejich předem definované frekvence v běžné stravě. Personál bude proškolen v metodě dietního rozhovoru. Výsledky FFQ budou dále importovány do počítačové verze FFQ, která automaticky odvozuje a normalizuje obsah živin z individuální stravy pacienta na základě známé izraelské databáze živin pro potraviny z Národního statistického institutu. Jak je znázorněno na obrázku z tohoto citlivého softwaru pro příkladného pacienta, každý barevný pruh označuje konkrétní spotřebu živin jednotlivcem (např. bílkoviny, oligosacharidy atd.), spolu s jejich odchylkou od normalizované spotřeby WHO (zelené rozmezí) . Metodika FFQ bude doplněna o validaci prospektivního třídenního záznamu dietního itineráře pomocí SmartPhone. Účastníci pořídí elektronické snímky všech potravin zkonzumovaných během těchto tří dnů. Fotografie budou nahrány do elektronické vizuální databáze a potraviny budou identifikovány, zaznamenány a ověřeny proti retrospektivnímu FFQ.

Abychom upřednostnili mezi mnoha environmentálními/dietními faktory, provedeme systematický přehled a metaanalýzu všech publikací týkajících se environmentálních rizikových faktorů CD. Vypočítáme sdružený poměr šancí a bodové odhady pro každou proměnnou a definujeme vážené efekty mezi proměnnými pomocí modelu náhodných efektů. To umožní rozebrat a identifikovat faktory, u kterých bylo nejvíce reprodukovatelně a robustně zjištěno spojení s výskytem CD. Poté budeme postupně upřednostňovat tyto proměnné, abychom analyzovali asociaci environmentálních faktorů s mikrobiomem, transkriptomem a perturbacemi PCP.