Patrones de respuesta intestinal a las señales microbianas

Solo se incluirán adultos mayores de 18 años. Se incluirán dos cohortes: una cohorte de pacientes con EC (incluidas subcohortes específicas de pacientes con EC conocidos y de nueva aparición y pacientes con EC que viajan y muestras patológicas archivadas de EC postoperatoria, total n= 300) y una cohorte de controles (individuos sanos y familiares de pacientes con EC, total n=200). Obtendremos muestras de heces y sangre y biopsias intestinales y/o muestras de resección de pacientes con EC, y muestras de sangre, heces y biopsias intestinales de individuos sanos y familiares asintomáticos que se sometan a una colonoscopia por motivos no relacionados con el estudio (por ejemplo, colonoscopia de detección). ).

Luego de firmar el consentimiento informado, se obtendrá muestra de heces y muestra de sangre (20cc). Las infecciones entéricas se excluirán mediante cultivos de heces, parásitos, incluida la entameba, y ensayo de C. difficile. Se analizarán los marcadores inflamatorios (PCR en sangre, calprotectina en heces). Las muestras de sangre se someterán a una caracterización inmunitaria, incluidas pruebas in vitro mediante activación de células inmunitarias, mediciones de secreción de citocinas y análisis de marcadores de superficie celular mediante FACS. Se recogerán dos muestras fecales por donante (≥3g o 3 mL cada una) en recipientes limpios a temperatura ambiente, congeladas frescas a -20 °C y luego almacenadas a -80 °C en 72 h. También obtendremos en la colonoscopia cuatro biopsias de mucosa ileal y colónica inflamada y no inflamada (total 8 biopsias). De cada individuo, se dividirán muestras para análisis en Sheba y para transferencia. El taburete se transferirá a la Prof. Elinav en el Instituto Weizmann para realizar metagenómica de escopeta del microbioma. La biopsia intestinal y/o las muestras de resección archivadas (histología) se transferirán al Prof. Stappenbeck de la Universidad de Washington, St. Louis, EE.

Las biopsias ileales y rectales se recolectarán y almacenarán inmediatamente en RNAlater. Se obtendrán biopsias de cada ubicación (inflamadas o no inflamadas, un total de 8 biopsias) y se utilizarán para la extracción de ARN y ADN microbiano. El ARN se utilizará para mRNAseq de tejido y el ADN para la caracterización microbiana. mRNAseq se realizará en el núcleo del centro de salud digestiva (DHC) respaldado por los NIH en el Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC), donde ya se analizaron >700 mRNAseq de diferentes cohortes de EII, incluidas las cohortes RISK CD y PROTECT UC con buenos resultados. La secuenciación del amplicón microbiano 16S de las heces y el ADN extraído por biopsia se realizará como se describió anteriormente.

Los pacientes de ambas cohortes también se someterán a una encuesta de exposición ambiental y dietética. Para la exposición ambiental, utilizaremos el cuestionario desarrollado por la Organización Internacional de EII (IOIBD), con alguna modificación. El cuestionario consta de 87 preguntas que cubren 25 temas diferentes propuestos como factores de riesgo ambientales para EC y/o CU. Este cuestionario se ha utilizado anteriormente en estudios epidemiológicos que investigan los desencadenantes de la EII, incluido uno realizado en el sudeste asiático y China. Las preguntas se relacionan con cinco áreas diferentes principales: (i) Factores infantiles hasta los 20 años, incluida la lactancia materna, apendicectomía, amigdalectomía, eczema, vacunas (tuberculosis, tos ferina, sarampión, rubéola, difteria, tétanos, poliomielitis), infecciones infantiles (sarampión, tos ferina). , rubéola, varicela, paperas, escarlatina) y tenencia de mascotas; (ii) hábitos alimentarios que incluyen el consumo diario, semanal o menos frecuente de frutas, verduras, huevo, cereal, pan, cereal, café, té, jugo, azúcar y comida rápida; (iii) hábito tabáquico (fumador actual, no fumador, exfumador); (iv) condiciones sanitarias tales como la disponibilidad de grifo de agua interno, grifo de agua caliente o inodoro con descarga; y (v) otros factores, incluida la actividad física diaria, la píldora anticonceptiva oral y los eventos estresantes antes del diagnóstico. También agregaremos al cuestionario IOIBD elementos relacionados con el uso de antibióticos antes y después de los 15 años, el uso de pasta de dientes y la presencia de empastes de amalgama durante la infancia o más adelante en la vida.

Para mapear los hábitos dietéticos, emplearemos una entrevista realizada por un dietista capacitado y utilizando el FFQ estructurado validado (Cuestionario de frecuencia de alimentos). Esta herramienta captura más de 600 alimentos, priorizados por su frecuencia predefinida en la dieta habitual. El personal será capacitado en el método de entrevista dietética. Los resultados de FFQ se importarán aún más a la versión FFQ computarizada, que deriva y normaliza automáticamente el contenido de nutrientes de la dieta de un paciente individual en función de la base de datos de nutrientes de alimentos israelíes conocidos del Instituto Nacional de Estadística. Como se muestra en la figura de captura de pantalla de este software receptivo para un paciente ejemplar, cada barra de color indica un consumo de nutrientes específico por parte del individuo (por ejemplo, proteína, oligosacáridos, etc.), junto con su divergencia del consumo normalizado por la OMS (rango de color verde) . La metodología FFQ se complementará con una validación prospectiva de un itinerario dietético de tres días capturado por SmartPhone. Los participantes tomarán fotografías electrónicas de todos los alimentos consumidos durante estos tres días. Las fotos se cargarán en una base de datos visual electrónica y los alimentos se identificarán, registrarán y verificarán con el FFQ retrospectivo.

Con el fin de priorizar entre los múltiples factores ambientales/dietéticos, realizaremos una revisión sistemática y un metanálisis de todas las publicaciones relacionadas con los factores de riesgo ambientales para la EC. Calcularemos la razón de probabilidades agrupada y las estimaciones puntuales para cada variable, y definiremos los efectos ponderados entre las variables utilizando el modelo de efectos aleatorios. Esto permitirá diseccionar e identificar los factores que se han encontrado de forma más reproducible y sólida asociados con la aparición de EC. A continuación, priorizaremos estas variables paso a paso, para el análisis de la asociación de factores ambientales con perturbaciones del microbioma, transcriptoma y PCP.