HIF-1α-stabilointi uutena terapeuttisena lähestymistapana sarkopeniaan. (HIF2)

Hypoksian aiheuttaman tekijä-1α:n (HIF-1α) ratkaiseva rooli myogeneesin aikana on osoitettu kahdessa äskettäisessä kannattajaryhmän julkaisussa (Cirillo et al., 2017a; Cirillo et al., 2020). Erityisesti osoitettiin, että lisääntyvät hiiren myoblastit, joita käsiteltiin 24 tuntia 1 % 02:n (hypoksia) olosuhteissa kasvualustassa ja sitten stimuloituja erilaistumaan 7 päivän ajan normaaleissa olosuhteissa (21 % O2), osoittivat hypertrofisten myoblastien muodostumista 1,4- kertainen erilaistumisindeksin nousu normoksisiin kontrolleihin verrattuna. Nämä tulokset vahvistettiin keskeisten erilaistumismerkkien analyysillä. Erityisesti hypoksiset esikäsitellyt myoblastit osoittivat vastaavasti 3-, 2,4- ja 1,33-kertaista lisäystä MyoD-tuman lokalisaatiossa, myogeniinin ilmentymisessä 3 päivän erilaistumisen jälkeen ja MHC-ilmentymisessä erilaistumisprosessin lopussa verrattuna kontrolleihin, vastaavasti. Lisäksi vahvistimme nämä löydökset luurankolihasten biopsioissa iäkkäiltä sarkopeenisilta potilailta verrattuna nuoriin yksilöihin. Löysimme HIF-1a:n ja sen kohdegeenien ilmentymisen vähentyneen sarkopeniassa sekä PAX7:n, satelliittisolujen tärkeimmän kantasolumarkkerin, ilmentymisen, kun taas atrofiamarkkeri MURF1 lisääntyi. Eristimme myös satelliittisoluja lihasbiopsioista ja viljelimme niitä in vitro. Havaitsimme, että HIF-1a:n ja sen kohdegeenien farmakologinen aktivaatio aiheutti luurankolihasten surkastumisen vähenemisen ja PAX7-geenin ilmentymisen aktivoitumisen. Yhteenvetona totean, että tässä työssä havaitsimme, että HIF-1α:lla on rooli sarkopeniassa ja se osallistuu satelliittisolujen homeostaasiin (Cirillo et al., 2022).

Ennakkotietojemme perusteella projektimme ensimmäinen osa keskittyy potilaiden rekrytointiin ja kliiniseen karakterisointiin. Tarkemmin sanottuna analyysit tehdään kahdelle erilliselle ryhmälle: sarkopeeninen ryhmä, joka koostuu 60 potilaasta, joilla on sarkopenia uusimpien ohjeiden mukaan (> 65 vuotta), ja kontrolliryhmä, joka koostuu 45 potilaasta, jotka eivät ole sarkopeenisia (ikä v. 18 ja 35 vuotta). Tutkimus suoritetaan sairaalan eettisen toimikunnan sääntöjen mukaisesti ja potilaiden tulee allekirjoittaa tietoinen suostumuslomake tutkimukseen osallistumiseksi. Potilaat rekrytoidaan 24 kuukaudeksi, joista 6 kuukautta on käytettävissä tietojen analysointiin. Rekrytointi tapahtuu rutiininomaisten ortopedisten tutkimusten aikana IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzissa potilaille, joille on suunniteltu ortopedinen leikkaus (nivelrikko, proksimaaliset reisiluun murtumat ja ALC-korjausleikkaus). Potilaat, joilla on samanaikaisia ​​sairauksia, mukaan lukien liikalihavuuteen liittyvä sarkopenia ja diabetes, suljetaan pois tutkimuksesta. Kaikille potilaille tehdään (a) DXA-kokonaiskeho, joka mahdollistaa kolmen kehon komponentin – luumineraali-, rasva- ja luun mineraalittoman massan – kvantifioinnin, (b) kädessä pidettävän dynamometrian pitovoiman arvioimiseksi ja (c) antropometrisen analyysin. (BMI) kehon rasvan arvioimiseksi. Sarkopenian laajuuden määrittämiseksi serologisella analyysillä otetaan verinäyte. Tämä sisältää tyypin III prokollageenin aminoterminaalisen propeptidin (P3NP), c-terminaalisen agriinifragmentin 22 (CAF22), osteonektiinin, irisiinin, rasvahappoja sitovan proteiinin 3 (FABP3) ja makrofagien migraatiota estävän tekijän (MIF) mittaamisen. pidetään sarkopenian tärkeimpinä ehdokasbiomarkkereina (Nogueira et al., 2019; Qaisar et al., 2020). Potilaiden rekrytoinnin jälkeen tutkimuksessa pyritään tunnistamaan muutokset HIF-1alfa-signalaatiossa sarkopenian aikana. Tarkemmin sanottuna sarkopeenisista ja kontrolliryhmistä kerätään useita luurankolihasten biopsioita, jotka tavallisesti hylätään leikkauksen aikana, jotta voidaan määrittää multiomiikka-lähestymistapoja ja histologisia määrityksiä. Erityisesti proteiinien kokonaismäärä uutetaan luurankolihasnäytteellä proteomianalyysien suorittamiseksi massaspektrometriaan ja solujen bioenergeettiseen aineenvaihduntaan perustuen Seahorse Real-Time Cell Metabolic Analysis -analyysillä laboratoriossamme. Proteomi- ja metabolomidatan tilastollinen analyysi keskittyy muutoksiin HIF-signaloinnin ja mitokondrioiden aktiivisuuden välillä. Proteomitulokset validoidaan teknisesti Western blot -menetelmällä käyttämällä spesifisiä vasta-aineita. Vain proteiinit, joiden ilmentymisero on vähintään 0,6, otetaan huomioon. Toisaalta luustolihasten biopsiaa käytetään myös histologiseen tutkimukseen. Pääpaino on 1) satelliittisolujen aktivaatiossa spesifisellä PAX7-vasta-aineella, 2) luuston lihasten surkastumisen kvantifiointi spesifisellä MuRF1-vasta-aineella, 2) ja lihassäikeen koostumuksen muutoksiin käyttämällä spesifisiä vasta-aineita, jotka on suunnattu myosiinin raskasketjutyyppiä I vastaan. IIA ja IIB.