Стабилизация HIF-1α как новый терапевтический подход к саркопении. (HIF2)

Решающая роль, которую играет индуцируемый гипоксией фактор-1α (HIF-1α) во время миогенеза, была продемонстрирована в двух недавних публикациях группы сторонников (Cirillo et al., 2017a; Cirillo et al., 2020). В частности, было показано, что пролиферирующие мышиные миобласты, обработанные в течение 24 часов в условиях 1% O2 (гипоксии) в питательной среде, а затем стимулированные к дифференцировке в течение 7 дней в нормоксических условиях (21% O2), показали образование гипертрофических мышечных трубок с 1,4- кратное увеличение индекса дифференцировки по сравнению с нормоксичным контролем. Эти результаты были подтверждены анализом ключевых маркеров дифференцировки. В частности, миобласты, предварительно обработанные гипоксией, показали 3-, 2,4- и 1,33-кратное увеличение ядерной локализации MyoD, экспрессии миогенина после 3 дней дифференцировки и экспрессии MHC в конце процесса дифференцировки по сравнению с контролем соответственно. Более того, мы подтвердили эти результаты при биопсии скелетных мышц пожилых пациентов с саркопенией по сравнению с биопсиями молодых людей. Мы обнаружили снижение экспрессии HIF-1α и его генов-мишеней при саркопении, а также PAX7, основного маркера стволовых клеток сателлитных клеток, тогда как маркер атрофии MURF1 был повышен. Мы также выделили сателлитные клетки из мышечных биоптатов и культивировали их in vitro. Мы обнаружили, что фармакологическая активация HIF-1α и его генов-мишеней вызывает снижение атрофии скелетных мышц и активацию экспрессии гена PAX7. В заключение, в этой работе мы обнаружили, что HIF-1α играет роль в саркопении и участвует в гомеостазе сателлитных клеток (Cirillo et al., 2022).

Учитывая наши предварительные данные, первая часть нашего проекта будет сосредоточена на наборе пациентов и их клинической характеристике. В частности, анализ будет проводиться в двух отдельных группах: группа с саркопенией, состоящая из 60 пациентов, страдающих саркопенией в соответствии с самыми последними рекомендациями (> 65 лет), и контрольная группа, состоящая из 45 пациентов, не страдающих саркопенией (в возрасте от 18 и 35 лет). Исследование будет проводиться в соответствии с правилами больничного комитета по этике, и пациенты должны будут подписать форму информированного согласия на участие в исследовании. Пациенты будут набираться на 24 месяца, из которых 6 месяцев будут доступны для анализа данных. Набор будет осуществляться во время плановых ортопедических осмотров в IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi пациентов, которым назначена ортопедическая операция (протезирование тазобедренного сустава из-за остеоартрита, переломы проксимального отдела бедренной кости и реконструктивная хирургия ALC). Пациенты с сопутствующими заболеваниями, включая саркопению, связанную с ожирением, и диабет, будут исключены из исследования. Всем пациентам будет проведена (а) DXA всего тела, которая позволяет количественно оценить три компонента тела: костно-минеральная, жировая и безминеральная костная масса, (b) ручная динамометрия для оценки силы захвата и (c) антропометрический анализ. (ИМТ) для оценки жировых отложений. Будет взят образец крови для определения степени саркопении с помощью серологического анализа. Это включает измерение аминоконцевого пропептида проколлагена типа III (P3NP), c-концевого фрагмента агрина 22 (CAF22), остеонектина, иризина, белка 3, связывающего жирные кислоты (FABP3), и фактора ингибирования миграции макрофагов (MIF), который считаются основными кандидатными биомаркерами саркопении (Nogueira et al., 2019; Qaisar et al., 2020). После набора пациентов исследование будет направлено на выявление изменений в передаче сигналов HIF-1альфа во время саркопении. В частности, множественные биопсии скелетных мышц, которые обычно отбрасываются во время операции, будут собраны у саркопенических и контрольных групп для разработки мультиомикальных подходов и гистологических анализов. В частности, общие белки будут извлечены из образца скелетных мышц для проведения анализа протеома на основе масс-спектрометрии и анализа клеточного биоэнергетического метаболизма с использованием клеточного метаболического анализа Seahorse в реальном времени в нашей лаборатории. Статистический анализ данных протеома и метаболома будет сосредоточен на изменениях в перекрестных помехах между передачей сигналов HIF и митохондриальной активностью. Результаты протеома будут технически подтверждены методом вестерн-блоттинга с использованием специфических антител. Будут рассматриваться только белки, демонстрирующие истинную разницу в экспрессии не менее 0,6. С другой стороны, биопсия скелетных мышц также будет использоваться для гистологического исследования. Основное внимание будет уделено 1) активации клеток-сателлитов специфическим антителом PAX7, 2) количественной оценке атрофии скелетных мышц специфическим антителом MuRF1, 2) и изменениям в составе мышечных волокон с использованием специфических антител, направленных против тяжелой цепи миозина I типа. IIA и IIB.