HIF-1α-stabilisering som en ny terapeutisk metod för sarkopeni. (HIF2)

Den avgörande roll som hypoxiinducerbar faktor-1α (HIF-1α) spelar under myogenesen har visats i två nyligen publicerade publikationer av förespråkargruppen (Cirillo et al., 2017a;Cirillo et al., 2020). Specifikt visades det att prolifererande murina myoblaster behandlade under 24 timmar under 1 % O2 (hypoxi) förhållanden i tillväxtmedium och sedan stimulerade att differentiera i 7 dagar under normoxiska förhållanden (21 % O2) visade bildningen av hypertrofiska myotuber med en 1,4- dubbla ökningen av differentieringsindex jämfört med normoxiska kontroller. Dessa resultat bekräftades genom analys av nyckeldifferentieringsmarkörer. Specifikt visade hypoxiska förbehandlade myoblaster en 3-, 2,4- och 1,33-faldig ökning av MyoD-kärnlokalisering, myogeninuttryck efter 3 dagars differentiering och MHC-uttryck i slutet av differentieringsprocessen jämfört med kontroller. Dessutom bekräftade vi dessa fynd i skelettmuskelbiopsier från äldre sarkopeniska patienter jämfört med de från unga individer. Vi fann en minskning av uttrycket av HIF-1α och dess målgener i sarkopeni, såväl som av PAX7, den viktigaste stamcellsmarkören för satellitceller, medan atrofimarkören MURF1 ökades. Vi isolerade också satellitceller från muskelbiopsier och odlade dem in vitro. Vi fann att en farmakologisk aktivering av HIF-1α och dess målgener orsakade en minskning av skelettmuskelatrofi och aktivering av PAX7-genuttryck. Sammanfattningsvis fann vi i detta arbete att HIF-1α spelar en roll vid sarkopeni och är involverad i satellitcellshomeostas (Cirillo et al., 2022).

Med tanke på våra preliminära data kommer den första delen av vårt projekt att fokusera på patientrekrytering och klinisk karakterisering. Specifikt kommer analyser att utföras på två separata grupper: den sarkopeniska gruppen, bestående av 60 patienter som drabbats av sarkopeni enligt de senaste riktlinjerna (> 65 år), och kontrollgruppen, bestående av 45 patienter som inte är sarkopeniska (i åldern mellan kl. 18 och 35 år). Studien kommer att genomföras i enlighet med reglerna för sjukhusets etiska kommitté och patienterna kommer att behöva underteckna ett informerat samtycke för att delta i studien. Patienter kommer att rekryteras under 24 månader, med 6 månader tillgängliga för dataanalys. Rekrytering kommer att ske under rutinmässiga ortopediska undersökningar på IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi hos patienter som är planerade för ortopedisk kirurgi (höftprotes på grund av artros, proximala lårbensfrakturer och ALC rekonstruktiv kirurgi). Patienter med komorbiditeter, inklusive fetma-relaterad sarkopeni och diabetes, kommer att exkluderas från studien. Alla patienter kommer att genomgå (a) DXA total body, vilket möjliggör kvantifiering av de tre kroppskomponenterna benmineral, fett och benmineralfri massa, (b) handhållen dynamometri för att bedöma greppstyrka och (c) antropometrisk analys (BMI) för att uppskatta kroppsfett. Ett blodprov kommer att samlas in för att bestämma omfattningen av sarkopeni genom serologisk analys. Detta involverar mätning av aminoterminal pro-peptid av prokollagen typ III (P3NP), c-terminalt agrinfragment 22 (CAF22), osteonektin, irisin, fettsyrabindande protein 3 (FABP3) och makrofagmigreringshämmande faktor (MIF), som anses vara de främsta kandidatbiomarkörerna för sarkopeni (Nogueira et al., 2019; Qaisar et al. al., 2020). Efter patientrekrytering kommer studien att syfta till att identifiera förändringar i HIF-1alfa-signalering under sarkopeni. Specifikt kommer flera skelettmuskelbiopsier, som normalt kasseras under operation, att samlas in från sarkopeniska grupper och kontrollgrupper för att skapa multiomics-metoder och histologiska analyser. I synnerhet kommer totala proteiner att extraheras av skelettmuskelprov för att utföra proteomanalyser baserade på masspektrometri och cellulär bioenergetisk metabolismanalys med hjälp av Seahorse Real-Time Cell Metabolic Analysis i vårt laboratorium. Statistisk analys av proteom- och metabolomdata kommer att fokusera på förändringar i överhörning mellan HIF-signalering och mitokondriell aktivitet. Proteomresultaten kommer att valideras tekniskt genom en Western blot-metod med användning av specifika antikroppar. Endast de proteiner som visar en sann skillnad i uttryck på minst 0,6 kommer att beaktas. Å andra sidan kommer skelettmuskelbiopsier också att användas för histologisk undersökning. Huvudfokus kommer att ligga på 1) aktivering av satellitceller av den specifika antikroppen PAX7, 2) kvantifiering av skelettmuskelatrofi av den specifika antikroppen MuRF1, 2) och förändringar i muskelfibersammansättning med användning av specifika antikroppar riktade mot myosin tung kedja typ I, IIA och IIB.