Estabilização de HIF-1α como uma nova abordagem terapêutica para sarcopenia. (HIF2)

O papel crucial desempenhado pelo fator 1α induzível por hipóxia (HIF-1α) durante a miogênese foi demonstrado em duas publicações recentes do grupo proponente (Cirillo et al., 2017a; Cirillo et al., 2020). Especificamente, foi demonstrado que mioblastos murinos em proliferação tratados por 24 horas sob condições de 1% de O2 (hipóxia) em meio de crescimento e depois estimulados para se diferenciarem por 7 dias sob condições normóxicas (21% de O2) mostraram a formação de miotubos hipertróficos com 1,4- aumento de vezes no índice de diferenciação em comparação com controles normóxicos. Estes resultados foram confirmados pela análise dos principais marcadores de diferenciação. Especificamente, os mioblastos hipóxicos pré-tratados mostraram um aumento de 3, 2,4 e 1,33 vezes na localização nuclear MyoD, expressão de miogenina após 3 dias de diferenciação e expressão de MHC no final do processo de diferenciação em comparação com controles, respectivamente. Além disso, confirmamos esses achados em biópsias de músculo esquelético de pacientes idosos sarcopênicos em comparação com indivíduos jovens. Encontramos uma diminuição na expressão de HIF-1α e seus genes alvo na sarcopenia, bem como de PAX7, o principal marcador de células-tronco de células satélites, enquanto o marcador de atrofia MURF1 estava aumentado. Também isolamos células satélites de biópsias musculares e as cultivamos in vitro. Descobrimos que uma ativação farmacológica do HIF-1α e seus genes alvo causou uma redução na atrofia do músculo esquelético e ativação da expressão do gene PAX7. Concluindo, neste trabalho descobrimos que o HIF-1α desempenha um papel na sarcopenia e está envolvido na homeostase das células satélites (Cirillo et al., 2022).

Considerando os nossos dados preliminares, a primeira parte do nosso projeto incidirá no recrutamento de pacientes e na caracterização clínica. Especificamente, as análises serão realizadas em dois grupos distintos: o grupo sarcopênico, composto por 60 pacientes afetados pela sarcopenia de acordo com as diretrizes mais recentes (> 65 anos), e o grupo controle, composto por 45 pacientes não sarcopênicos (com idade entre 18 e 35 anos). O estudo será conduzido de acordo com as normas do comitê de ética do hospital e os pacientes serão obrigados a assinar um termo de consentimento livre e esclarecido para participar do estudo. Os pacientes serão recrutados por 24 meses, com 6 meses disponíveis para análise de dados. O recrutamento ocorrerá durante exames ortopédicos de rotina no IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi em pacientes agendados para cirurgia ortopédica (artroplastia de quadril por osteoartrite, fraturas proximais do fêmur e cirurgia reconstrutiva ALC). Pacientes com comorbidades, incluindo sarcopenia relacionada à obesidade e diabetes, serão excluídos do estudo. Todos os pacientes serão submetidos a (a) DXA corporal total, que permite a quantificação dos três componentes corporais massa mineral óssea, gordura e massa livre de minerais ósseos, (b) dinamometria portátil para avaliar a força de preensão e (c) análise antropométrica (IMC) para estimar a gordura corporal. Uma amostra de sangue será coletada para determinar a extensão da sarcopenia por análise sorológica. Isso envolve a medição do pró-peptídeo amino-terminal do procolágeno tipo III (P3NP), fragmento 22 da agrina c-terminal (CAF22), osteonectina, irisina, proteína de ligação a ácidos graxos 3 (FABP3) e fator inibitório da migração de macrófagos (MIF), que são considerados os principais candidatos a biomarcadores da sarcopenia (Nogueira et al., 2019;Qaisar et al., 2020). Após o recrutamento dos pacientes, o estudo terá como objetivo identificar alterações na sinalização do HIF-1alfa durante a sarcopenia. Especificamente, múltiplas biópsias de músculo esquelético, normalmente descartadas durante a cirurgia, serão coletadas de grupos sarcopênicos e de controle para estabelecer abordagens multiômicas e ensaios histológicos. Em particular, proteínas totais serão extraídas de amostras de músculo esquelético para realizar análises de proteoma baseadas em espectrometria de massa e ensaio de metabolismo bioenergético celular usando Seahorse Real-Time Cell Metabolic Analysis em nosso laboratório. A análise estatística dos dados do proteoma e do metaboloma focará nas mudanças na conversa cruzada entre a sinalização HIF e a atividade mitocondrial. Os resultados do proteoma serão validados tecnicamente por uma abordagem Western blot utilizando anticorpos específicos. Somente as proteínas que apresentarem uma diferença real na expressão de pelo menos 0,6 serão consideradas. Por outro lado, biópsias do músculo esquelético também serão utilizadas para exame histológico. O foco principal será 1) ativação de células satélites pelo anticorpo específico PAX7, 2) quantificação da atrofia muscular esquelética pelo anticorpo específico MuRF1, 2) e alterações na composição das fibras musculares utilizando anticorpos específicos direcionados contra a cadeia pesada da miosina tipo I, IIA e IIB.