HIF-1α-stabilisering som en ny terapeutisk tilgang til sarkopeni. (HIF2)

Den afgørende rolle, som hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α) spiller under myogenese, er blevet demonstreret i to nyere publikationer af proponentgruppen (Cirillo et al., 2017a;Cirillo et al., 2020). Specifikt blev det vist, at prolifererende murine myoblaster behandlet i 24 timer under 1% O2 (hypoxi) betingelser i vækstmedium og derefter stimuleret til at differentiere i 7 dage under normoxiske forhold (21% O2) viste dannelsen af ​​hypertrofiske myotuber med en 1,4- fold stigning i differentieringsindeks sammenlignet med normoksiske kontroller. Disse resultater blev bekræftet ved analyse af nøgledifferentieringsmarkører. Specifikt viste hypoxiske forbehandlede myoblaster en 3-, 2,4- og 1,33-fold stigning i MyoD nuklear lokalisering, myogeninekspression efter 3 dages differentiering og MHC-ekspression ved afslutningen af ​​differentieringsprocessen sammenlignet med kontroller. Desuden bekræftede vi disse fund i skeletmuskelbiopsier fra ældre sarkopeniske patienter sammenlignet med dem fra unge individer. Vi fandt et fald i ekspressionen af ​​HIF-1α og dets målgener i sarkopeni, såvel som af PAX7, den vigtigste stamcellemarkør for satellitceller, hvorimod atrofimarkøren MURF1 var øget. Vi isolerede også satellitceller fra muskelbiopsier og dyrkede dem in vitro. Vi fandt ud af, at en farmakologisk aktivering af HIF-1α og dets målgener forårsagede en reduktion i skeletmuskelatrofi og aktivering af PAX7-genekspression. Som konklusion fandt vi i dette arbejde, at HIF-1α spiller en rolle i sarkopeni og er involveret i satellitcellehomeostase (Cirillo et al., 2022).

I betragtning af vores foreløbige data, vil den første del af vores projekt fokusere på patientrekruttering og klinisk karakterisering. Konkret vil der blive analyseret på to separate grupper: den sarkopeniske gruppe, bestående af 60 patienter ramt af sarkopeni efter de seneste retningslinjer (> 65 år), og kontrolgruppen, bestående af 45 patienter, der ikke er sarkopeniske (i alderen mellem kl. 18 og 35 år). Undersøgelsen vil blive udført i overensstemmelse med reglerne for hospitalets etiske komité, og patienter vil blive bedt om at underskrive en informeret samtykkeerklæring for at deltage i undersøgelsen. Patienter vil blive rekrutteret i 24 måneder, med 6 måneder til rådighed for dataanalyse. Rekruttering vil finde sted under rutinemæssige ortopædiske undersøgelser hos IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi hos patienter, der er planlagt til ortopædkirurgi (hofteprotese på grund af slidgigt, proksimale lårbensfrakturer og ALC rekonstruktiv kirurgi). Patienter med komorbiditeter, herunder fedme-relateret sarkopeni og diabetes, vil blive udelukket fra undersøgelsen. Alle patienter vil gennemgå (a) DXA total body, som muliggør kvantificering af de tre kropskomponenter knoglemineral-, fedt- og knoglemineralfri masse, (b) håndholdt dynamometri for at vurdere grebsstyrke og (c) antropometrisk analyse (BMI) til at estimere kropsfedt. En blodprøve vil blive indsamlet for at bestemme omfanget af sarkopeni ved serologisk analyse. Dette involverer måling af aminoterminalt pro-peptid af procollagen type III (P3NP), c-terminalt agrinfragment 22 (CAF22), osteonectin, irisin, fedtsyrebindende protein 3 (FABP3) og makrofag-migreringshæmmende faktor (MIF), som betragtes som de vigtigste kandidatbiomarkører for sarkopeni (Nogueira et al., 2019; Qaisar et al. al., 2020). Efter patientrekruttering vil undersøgelsen sigte mod at identificere ændringer i HIF-1alfa-signalering under sarkopeni. Specifikt vil flere skeletmuskelbiopsier, som normalt kasseres under operationen, blive indsamlet fra sarkopeniske grupper og kontrolgrupper for at opsætte multiomics-tilgange og histologiske assays. Især vil totale proteiner blive ekstraheret af skeletmuskelprøve for at udføre proteomanalyser baseret på massespektrometri og cellulær bioenergetisk metabolismeanalyse ved hjælp af Seahorse Real-Time Cell Metabolic Analysis i vores laboratorium. Statistisk analyse af proteom- og metabolomdata vil fokusere på ændringer i krydstale mellem HIF-signalering og mitokondriel aktivitet. Proteomresultaterne vil blive teknisk valideret ved en Western blot-tilgang ved anvendelse af specifikke antistoffer. Kun de proteiner, der viser en sand forskel i ekspression på mindst 0,6, vil blive taget i betragtning. På den anden side vil skeletmuskelbiopsier også blive brugt til histologisk undersøgelse. Hovedfokus vil være på 1) aktivering af satellitceller med det specifikke antistof PAX7, 2) kvantificering af skeletmuskelatrofi ved det specifikke antistof MuRF1, 2) og ændringer i muskelfibersammensætning ved hjælp af specifikke antistoffer rettet mod myosin tung kæde type I, IIA og IIB.