HIF-1α-stabilisering som en ny terapeutisk tilnærming for sarkopeni. (HIF2)

Den avgjørende rollen som hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) spiller under myogenese har blitt demonstrert i to nyere publikasjoner av proponentgruppen (Cirillo et al., 2017a;Cirillo et al., 2020). Spesifikt ble det vist at prolifererende murine myoblaster behandlet i 24 timer under 1 % O2 (hypoksi) forhold i vekstmedium og deretter stimulert til å differensiere i 7 dager under normoksiske forhold (21 % O2) viste dannelse av hypertrofiske myotuber med en 1,4- ganger økning i differensieringsindeks sammenlignet med normoksiske kontroller. Disse resultatene ble bekreftet ved analyse av sentrale differensieringsmarkører. Spesifikt viste hypoksiske forbehandlede myoblaster en 3-, 2,4- og 1,33 ganger økning i MyoD-kjernelokalisering, myogeninekspresjon etter 3 dagers differensiering og MHC-ekspresjon ved slutten av differensieringsprosessen sammenlignet med kontroller. Dessuten bekreftet vi disse funnene i skjelettmuskelbiopsier fra eldre sarkopeniske pasienter sammenlignet med de fra unge individer. Vi fant en reduksjon i uttrykket av HIF-1α og dets målgener i sarkopeni, så vel som av PAX7, den viktigste stamcellemarkøren til satellittceller, mens atrofimarkøren MURF1 ble økt. Vi isolerte også satellittceller fra muskelbiopsier og dyrket dem in vitro. Vi fant at en farmakologisk aktivering av HIF-1α og dets målgener forårsaket en reduksjon i skjelettmuskelatrofi og aktivering av PAX7-genuttrykk. Avslutningsvis fant vi i dette arbeidet at HIF-1α spiller en rolle i sarkopeni og er involvert i satellittcellehomeostase (Cirillo et al., 2022).

Tatt i betraktning våre foreløpige data, vil den første delen av prosjektet vårt fokusere på pasientrekruttering og klinisk karakterisering. Konkret vil det bli utført analyser på to separate grupper: den sarkopeniske gruppen, bestående av 60 pasienter rammet av sarkopeni i henhold til de nyeste retningslinjene (> 65 år), og kontrollgruppen, bestående av 45 pasienter som ikke er sarkopeniske (i alderen mellom kl. 18 og 35 år). Studien vil bli utført i henhold til reglene til sykehusets etiske komité og pasienter vil bli pålagt å signere et informert samtykkeskjema for å delta i studien. Pasienter vil bli rekruttert i 24 måneder, med 6 måneder tilgjengelig for dataanalyse. Rekruttering vil finne sted under rutinemessige ortopediske undersøkelser ved IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi hos pasienter som er planlagt for ortopedisk kirurgi (hofteprotese på grunn av slitasjegikt, proksimale femurfrakturer og ALC rekonstruktiv kirurgi). Pasienter med komorbiditeter, inkludert fedme-relatert sarkopeni og diabetes, vil bli ekskludert fra studien. Alle pasienter vil gjennomgå (a) DXA total body, som tillater kvantifisering av de tre kroppskomponentene beinmineral, fett og benmineralfri masse, (b) håndholdt dynamometri for å vurdere grepsstyrke og (c) antropometrisk analyse (BMI) for å beregne kroppsfett. En blodprøve vil bli tatt for å bestemme omfanget av sarkopeni ved serologisk analyse. Dette innebærer måling av aminoterminalt pro-peptid av prokollagen type III (P3NP), c-terminalt agrinfragment 22 (CAF22), osteonektin, irisin, fettsyrebindende protein 3 (FABP3) og makrofagmigrasjonshemmende faktor (MIF), som anses som de viktigste biomarkørene for sarkopeni (Nogueira et al., 2019; Qaisar et al. al., 2020). Etter pasientrekruttering vil studien ta sikte på å identifisere endringer i HIF-1alfa-signalering under sarkopeni. Spesifikt vil flere skjelettmuskelbiopsier, som normalt kasseres under operasjonen, samles inn fra sarkopeniske grupper og kontrollgrupper for å sette opp multi-omics-tilnærminger og histologiske analyser. Spesielt vil totale proteiner bli ekstrahert av skjelettmuskelprøver for å utføre proteomanalyser basert på massespektrometri og cellulær bioenergetisk metabolismeanalyse ved bruk av Seahorse Real-Time Cell Metabolic Analysis i laboratoriet vårt. Statistisk analyse av proteom- og metabolomdataene vil fokusere på endringer i krysstale mellom HIF-signalering og mitokondriell aktivitet. Proteomresultatene vil bli teknisk validert ved en Western blot-tilnærming ved bruk av spesifikke antistoffer. Bare proteiner som viser en sann forskjell i uttrykk på minst 0,6 vil bli vurdert. På den annen side vil skjelettmuskelbiopsier også brukes til histologisk undersøkelse. Hovedfokus vil være på 1) aktivering av satellittceller av det spesifikke antistoffet PAX7, 2) kvantifisering av skjelettmuskelatrofi ved det spesifikke antistoffet MuRF1, 2) og endringer i muskelfibersammensetning ved bruk av spesifikke antistoffer rettet mot myosin tungkjede type I, IIA og IIB.