Stabilizzazione HIF-1α come nuovo approccio terapeutico per la sarcopenia. (HIF2)

Il ruolo cruciale svolto dal fattore 1α inducibile dall'ipossia (HIF-1α) durante la miogenesi è stato dimostrato in due recenti pubblicazioni del gruppo proponente (Cirillo et al., 2017a; Cirillo et al., 2020). Nello specifico, è stato dimostrato che mioblasti murini proliferanti trattati per 24 ore in condizioni di 1% O2 (ipossia) in un mezzo di crescita e poi stimolati a differenziarsi per 7 giorni in condizioni normossiche (21% O2) hanno mostrato la formazione di miotubi ipertrofici con un 1,4- aumento dell’indice di differenziazione rispetto ai controlli normossici. Questi risultati sono stati confermati dall'analisi dei principali marcatori di differenziazione. Nello specifico, i mioblasti pretrattati ipossici hanno mostrato un aumento di 3, 2,4 e 1,33 volte nella localizzazione nucleare di MyoD, nell'espressione di miogenina dopo 3 giorni di differenziazione e nell'espressione di MHC alla fine del processo di differenziazione rispetto ai controlli, rispettivamente. Inoltre, abbiamo confermato questi risultati nelle biopsie dei muscoli scheletrici di pazienti sarcopenici anziani rispetto a quelle di individui giovani. Abbiamo riscontrato una diminuzione dell’espressione di HIF-1α e dei suoi geni bersaglio nella sarcopenia, nonché di PAX7, il principale marcatore di cellule staminali delle cellule satellite, mentre il marcatore di atrofia MURF1 era aumentato. Abbiamo anche isolato le cellule satellite dalle biopsie muscolari e le abbiamo coltivate in vitro. Abbiamo scoperto che un'attivazione farmacologica di HIF-1α e dei suoi geni bersaglio ha causato una riduzione dell'atrofia del muscolo scheletrico e l'attivazione dell'espressione del gene PAX7. In conclusione, in questo lavoro abbiamo scoperto che HIF-1α svolge un ruolo nella sarcopenia ed è coinvolto nell'omeostasi delle cellule satellite (Cirillo et al., 2022).

Considerando i nostri dati preliminari, la prima parte del nostro progetto si concentrerà sul reclutamento dei pazienti e sulla caratterizzazione clinica. Nello specifico, le analisi verranno effettuate su due gruppi distinti: il gruppo sarcopenico, costituito da 60 pazienti affetti da sarcopenia secondo le più recenti linee guida (> 65 anni), ed il gruppo di controllo, costituito da 45 pazienti non sarcopenici (di età compresa tra 18 e 35 anni). Lo studio sarà condotto secondo le regole del comitato etico dell'ospedale e ai pazienti verrà richiesto di firmare un modulo di consenso informato per partecipare allo studio. I pazienti verranno reclutati per 24 mesi, con 6 mesi a disposizione per l'analisi dei dati. Il reclutamento avverrà durante le visite ortopediche di routine presso l'IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi in pazienti in attesa di intervento di chirurgia ortopedica (protesi d'anca per artrosi, fratture prossimali del femore e chirurgia ricostruttiva ALC). I pazienti con comorbidità, tra cui sarcopenia e diabete legati all'obesità, saranno esclusi dallo studio. Tutti i pazienti saranno sottoposti a (a) DXA total body, che consente la quantificazione dei tre componenti corporei: minerale osseo, grasso e massa minerale ossea, (b) dinamometria manuale per valutare la forza di presa e (c) analisi antropometrica (BMI) per stimare il grasso corporeo. Verrà raccolto un campione di sangue per determinare l'entità della sarcopenia mediante analisi sierologica. Ciò comporta la misurazione del pro-peptide aminoterminale del procollagene di tipo III (P3NP), del frammento 22 dell'agrina c-terminale (CAF22), dell'osteonectina, dell'irisina, della proteina legante gli acidi grassi 3 (FABP3) e del fattore inibitorio della migrazione dei macrofagi (MIF), che sono considerati i principali biomarcatori candidati della sarcopenia (Nogueira et al., 2019;Qaisar et al., 2020). Dopo il reclutamento dei pazienti, lo studio mirerà a identificare i cambiamenti nella segnalazione di HIF-1alfa durante la sarcopenia. Nello specifico, biopsie multiple di muscoli scheletrici, normalmente scartate durante l'intervento chirurgico, verranno raccolte da gruppi sarcopenici e di controllo per impostare approcci multi-omici e test istologici. In particolare, le proteine ​​totali verranno estratte dal campione di muscolo scheletrico per eseguire analisi del proteoma basate sulla spettrometria di massa e sul test del metabolismo bioenergetico cellulare utilizzando l'analisi metabolica cellulare in tempo reale Seahorse nel nostro laboratorio. L'analisi statistica dei dati del proteoma e del metaboloma si concentrerà sui cambiamenti nella diafonia tra la segnalazione HIF e l'attività mitocondriale. I risultati del proteoma saranno validati tecnicamente mediante un approccio Western blot utilizzando anticorpi specifici. Verranno prese in considerazione solo le proteine ​​che mostrano una differenza reale nell'espressione di almeno 0,6. D'altra parte, le biopsie dei muscoli scheletrici verranno utilizzate anche per l'esame istologico. L'obiettivo principale sarà 1) attivazione delle cellule satellite da parte dell'anticorpo specifico PAX7, 2) quantificazione dell'atrofia del muscolo scheletrico da parte dell'anticorpo specifico MuRF1, 2) e cambiamenti nella composizione delle fibre muscolari utilizzando anticorpi specifici diretti contro la catena pesante della miosina di tipo I, IIA e IIB.