HIF-1α-stabilisatie als een nieuwe therapeutische aanpak voor sarcopenie. (HIF2)

De cruciale rol die hypoxie-induceerbare factor-1α (HIF-1α) speelt tijdens myogenese is aangetoond in twee recente publicaties van de voorstandersgroep (Cirillo et al., 2017a; Cirillo et al., 2020). In het bijzonder werd aangetoond dat prolifererende muriene myoblasten, behandeld gedurende 24 uur onder 1% O2 (hypoxie) omstandigheden in groeimedium en vervolgens gestimuleerd om te differentiëren gedurende 7 dagen onder normoxische omstandigheden (21% O2), de vorming vertoonden van hypertrofische myotubes met een 1,4- voudige toename van de differentiatie-index vergeleken met normoxische controles. Deze resultaten werden bevestigd door analyse van belangrijke differentiatiemarkers. Specifiek vertoonden hypoxische voorbehandelde myoblasten een 3-, 2,4- en 1,33-voudige toename in respectievelijk MyoD-nucleaire lokalisatie, myogenine-expressie na 3 dagen differentiatie en MHC-expressie aan het einde van het differentiatieproces vergeleken met controles. Bovendien hebben we deze bevindingen bevestigd in skeletspierbiopten van oudere sarcopenische patiënten vergeleken met die van jonge individuen. We vonden een afname in de expressie van HIF-1α en zijn doelgenen bij sarcopenie, evenals van PAX7, de belangrijkste stamcelmarker van satellietcellen, terwijl de atrofiemarker MURF1 verhoogd was. We hebben ook satellietcellen geïsoleerd uit spierbiopten en deze in vitro gekweekt. We ontdekten dat een farmacologische activering van HIF-1α en zijn doelgenen een vermindering van de skeletspieratrofie en activering van PAX7-genexpressie veroorzaakte. Concluderend hebben we in dit werk ontdekt dat HIF-1α een rol speelt bij sarcopenie en betrokken is bij de homeostase van satellietcellen (Cirillo et al., 2022).

Gezien onze voorlopige gegevens zal het eerste deel van ons project zich richten op de rekrutering van patiënten en klinische karakterisering. Concreet zullen analyses worden uitgevoerd op twee afzonderlijke groepen: de sarcopenische groep, bestaande uit 60 patiënten met sarcopenie volgens de meest recente richtlijnen (> 65 jaar), en de controlegroep, bestaande uit 45 patiënten die niet sarcopenie hebben (leeftijd tussen 18 en 35 jaar). Het onderzoek zal worden uitgevoerd volgens de regels van de ethische commissie van het ziekenhuis en patiënten zullen een geïnformeerde toestemmingsformulier moeten ondertekenen om aan het onderzoek deel te nemen. Patiënten worden voor 24 maanden gerekruteerd, waarvan 6 maanden beschikbaar zijn voor data-analyse. De rekrutering zal plaatsvinden tijdens routinematige orthopedische onderzoeken bij het IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi bij patiënten die gepland zijn voor orthopedische chirurgie (heupvervanging vanwege artrose, proximale femurfracturen en ALC-reconstructieve chirurgie). Patiënten met comorbiditeiten, waaronder aan obesitas gerelateerde sarcopenie en diabetes, zullen van het onderzoek worden uitgesloten. Alle patiënten zullen (a) het totale lichaam DXA ondergaan, wat kwantificering van de drie lichaamscomponenten botmineraal-, vet- en botmineraalvrije massa mogelijk maakt, (b) handdynamometrie om de grijpkracht te beoordelen, en (c) antropometrische analyse (BMI) om lichaamsvet te schatten. Er zal een bloedmonster worden afgenomen om de omvang van sarcopenie te bepalen door middel van serologische analyse. Dit omvat het meten van amino-terminaal propeptide van procollageen type III (P3NP), c-terminaal agrinefragment 22 (CAF22), osteonectine, irisine, vetzuurbindend eiwit 3 (FABP3) en macrofaagmigratie-remmende factor (MIF), die worden beschouwd als de belangrijkste kandidaat-biomarkers voor sarcopenie (Nogueira et al., 2019;Qaisar et al., 2020). Na de rekrutering van patiënten zal het onderzoek zich richten op het identificeren van veranderingen in de HIF-1alpha-signalering tijdens sarcopenie. Concreet zullen meerdere skeletspierbiopten, die normaal gesproken tijdens een operatie worden weggegooid, worden verzameld uit sarcopenische en controlegroepen om multi-omics benaderingen en histologische testen op te zetten. In het bijzonder zullen totale eiwitten worden geëxtraheerd door skeletspiermonsters om proteoomanalyses uit te voeren op basis van massaspectrometrie en cellulaire bio-energetische metabolismetest met behulp van Seahorse Real-Time Cell Metabolic Analysis in ons laboratorium. Statistische analyse van de proteoom- en metaboloomgegevens zal zich concentreren op veranderingen in de overspraak tussen HIF-signalering en mitochondriale activiteit. De proteoomresultaten zullen technisch gevalideerd worden door een Western blot-benadering met behulp van specifieke antilichamen. Alleen de eiwitten die een werkelijk verschil in expressie vertonen van ten minste 0,6 zullen in aanmerking worden genomen. Anderzijds zullen skeletspierbiopten ook gebruikt worden voor histologisch onderzoek. De nadruk zal vooral liggen op 1) activering van satellietcellen door het specifieke antilichaam PAX7, 2) kwantificering van skeletspieratrofie door het specifieke antilichaam MuRF1, 2) en veranderingen in de spiervezelsamenstelling met behulp van specifieke antilichamen gericht tegen myosine zware keten type I, IIA en IIB.