Stabilizace HIF-1α jako nový terapeutický přístup pro sarkopenii. (HIF2)

Klíčová role, kterou hraje hypoxií indukovatelný faktor-1α (HIF-1α) během myogeneze, byla prokázána ve dvou nedávných publikacích skupiny zastánců (Cirillo et al., 2017a;Cirillo et al., 2020). Konkrétně bylo prokázáno, že proliferující myší myoblasty ošetřené po dobu 24 hodin za podmínek 1% O2 (hypoxie) v růstovém médiu a poté stimulované k diferenciaci po dobu 7 dnů v normoxických podmínkách (21% O2) vykazovaly tvorbu hypertrofických myotubusů s 1,4- násobné zvýšení indexu diferenciace ve srovnání s normoxickými kontrolami. Tyto výsledky byly potvrzeny analýzou klíčových diferenciačních markerů. Konkrétně hypoxické předem ošetřené myoblasty vykazovaly 3-, 2,4- a 1,33-násobné zvýšení jaderné lokalizace MyoD, exprese myogeninu po 3 dnech diferenciace a exprese MHC na konci procesu diferenciace ve srovnání s kontrolami. Navíc jsme tyto nálezy potvrdili v biopsiích kosterního svalstva u starších sarkopenických pacientů ve srovnání s biopsiemi od mladých jedinců. Zjistili jsme snížení exprese HIF-1α a jeho cílových genů u sarkopenie, stejně jako PAX7, hlavního markeru kmenových buněk satelitních buněk, zatímco marker atrofie MURF1 byl zvýšen. Také jsme izolovali satelitní buňky ze svalových biopsií a kultivovali je in vitro. Zjistili jsme, že farmakologická aktivace HIF-1α a jeho cílových genů způsobila snížení atrofie kosterního svalstva a aktivaci exprese genu PAX7. Na závěr jsme v této práci zjistili, že HIF-1α hraje roli v sarkopenii a podílí se na homeostáze satelitních buněk (Cirillo et al., 2022).

S ohledem na naše předběžná data se první část našeho projektu zaměří na získávání pacientů a klinickou charakteristiku. Konkrétně budou analýzy provedeny na dvou samostatných skupinách: sarkopenická skupina, sestávající ze 60 pacientů postižených sarkopenií podle nejnovějších doporučení (> 65 let), a kontrolní skupina sestávající ze 45 pacientů, kteří nejsou sarkopeničtí (ve věku mezi 18 a 35 let). Studie bude provedena v souladu s pravidly nemocniční etické komise a pacienti budou muset podepsat informovaný souhlas s účastí ve studii. Pacienti budou přijímáni na 24 měsíců, přičemž 6 měsíců bude k dispozici pro analýzu dat. Nábor bude probíhat během rutinních ortopedických vyšetření v IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi u pacientů plánovaných na ortopedickou operaci (náhrada kyčelního kloubu v důsledku osteoartrózy, zlomeniny proximálního femuru a rekonstrukční operace ALC). Pacienti s komorbiditami, včetně sarkopenie související s obezitou a diabetu, budou ze studie vyloučeni. Všichni pacienti podstoupí (a) DXA celkové tělo, které umožňuje kvantifikaci tří tělesných složek kostního minerálu, tuku a kostní hmoty bez minerálních látek, (b) ruční dynamometrii k posouzení síly úchopu a (c) antropometrickou analýzu (BMI) k odhadu tělesného tuku. Bude odebrán vzorek krve pro stanovení rozsahu sarkopenie sérologickým rozborem. To zahrnuje měření amino-terminálního pro-peptidu prokolagenu typu III (P3NP), c-terminálního agrinového fragmentu 22 (CAF22), osteonektinu, irisinu, proteinu vázajícího mastné kyseliny 3 (FABP3) a inhibičního faktoru migrace makrofágů (MIF), které jsou považovány za hlavní kandidátní biomarkery sarkopenie (Nogueira et al., 2019; Qaisar et al., 2020). Po náboru pacientů se studie zaměří na identifikaci změn v signalizaci HIF-1alfa během sarkopenie. Konkrétně bude od sarkopenických a kontrolních skupin odebráno několik biopsií kosterního svalstva, které se normálně během chirurgického zákroku vyřadí, za účelem nastavení multi-omických přístupů a histologických testů. Konkrétně budou ze vzorku kosterního svalu extrahovány celkové proteiny, aby bylo možné provést analýzy proteomů založené na hmotnostní spektrometrii a testu buněčného bioenergetického metabolismu pomocí Seahorse Real-Time Cell Metabolic Analysis v naší laboratoři. Statistická analýza dat proteomu a metabolomu se zaměří na změny v cross-talk mezi HIF signalizací a mitochondriální aktivitou. Výsledky proteomu budou technicky ověřeny metodou Western blot s použitím specifických protilátek. Budou uvažovány pouze proteiny vykazující skutečný rozdíl v expresi alespoň 0,6. Na druhou stranu biopsie kosterního svalstva poslouží i k histologickému vyšetření. Hlavní pozornost bude věnována 1) aktivaci satelitních buněk specifickou protilátkou PAX7, 2) kvantifikaci atrofie kosterního svalstva specifickou protilátkou MuRF1, 2) a změnám ve složení svalových vláken pomocí specifických protilátek namířených proti těžkému řetězci myosinu typu I, IIA a IIB.