Dérivation de nouvelles lignées de cellules souches embryonnaires humaines à usage clinique

Les lignées de cellules souches embryonnaires (ES) sont dérivées des cellules pluripotentes de l'embryon précoce. Les propriétés clés des cellules ES sont leur capacité à proliférer indéfiniment in vitro sans différenciation, et leur capacité à donner naissance à toutes les cellules du corps. La dérivation récente de lignées cellulaires ES à partir d'embryons humains (Thomson et al., 1998, Reubinoff et al., 2000) attire une attention particulière en raison du potentiel remarquable de ces cellules pour la recherche scientifique fondamentale, le développement de médicaments et la médecine régénérative.

Étant donné que les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont capables d'un renouvellement illimité et peuvent donner naissance à n'importe quelle cellule spécialisée par différenciation, elles peuvent potentiellement être utilisées comme source illimitée de donneurs de cellules pour la transplantation dans une variété de troubles résultant de la perte des cellules ou un dysfonctionnement cellulaire. Parmi ces conditions figurent la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, les lésions traumatiques de la moelle épinière, le diabète, l'insuffisance cardiaque, l'insuffisance hépatique, etc.

Il a été proposé que les caractéristiques essentielles des cellules ES de primate devraient inclure (i) la dérivation de l'embryon préimplantatoire ou périimplantatoire, (ii) une prolifération indifférenciée prolongée et (iii) un potentiel de développement stable pour former des dérivés des trois couches germinales embryonnaires même après culture prolongée (Thomson, 1996). Les chercheurs ont dérivé des lignées de cellules souches d'embryons humains précoces qui répondent à ces critères (Reubinoff et al., 2000). Notre groupe a été le deuxième au monde à dériver des lignées de CSEh et le premier à montrer leur potentiel à subir une différenciation somatique in vitro (Reubinoff et al., 2000).

Pour exploiter le potentiel remarquable des CSEh, l'amélioration des méthodes actuellement utilisées pour la culture et la manipulation des cellules ainsi que le contrôle de leur différenciation sont nécessaires. Dans ce contexte, les chercheurs ont développé de nouvelles approches pour cryoconserver (Reubinoff et al., 2001), modifier génétiquement (Gropp et al., 2003 ; Ben-Dor et al., 2006) et contrôler la différenciation des cellules CSEh ( Reubinoff et al., 2001, Itsykson et al., 2005).

Les lignées de cellules ES humaines sont dérivées d'embryons produits par fécondation in vitro (FIV) à des fins cliniques. Les embryons congelés excédentaires qui ne sont plus nécessaires pour le traitement de l'infertilité sont recrutés à cette fin après avoir obtenu le consentement éclairé du donneur et les approbations du comité d'examen institutionnel/national. Les embryons sont décongelés et cultivés jusqu'au stade de blastocyste (5-6 jours), la masse cellulaire interne (ICM) composée de cellules pluripotentes est isolée et les cellules souches sont le plus souvent cultivées sur une couche de cellules nourricières de fibroblastes embryonnaires de souris. La couche nourricière est nécessaire pour empêcher la différenciation et favoriser la prolifération des cellules souches.

La plupart des lignées de CSEh signalées dans le monde à ce jour et toutes les lignées cellulaires actuellement répertoriées dans le registre du NIH ont été dérivées de couches nourricières de fibroblastes de souris. Les lignées actuelles ne seraient pas adaptées à une utilisation clinique, car le dépistage des donneurs et des réactifs n'était pas conforme à la FDA, et la présence des nourrisseurs de souris fait de ces lignées des produits de xénotransplantation. Les problèmes de conformité réglementaire que ces lignes soulèvent rendent difficile l'obtention de l'approbation de la FDA pour l'utilisation de la transplantation humaine.

Pour éliminer l'utilisation de mangeoires pour souris, les CSEh indifférenciées peuvent être propagées avec succès sur des surfaces en plastique recouvertes de laminine ou de Matrigel en présence d'un milieu conditionné par des fibroblastes embryonnaires de souris (Xu et al 2001). Bien que ce système évite le contact direct entre les mangeoires de souris et les CSEh, le risque de transfert croisé d'agents pathogènes animaux du milieu conditionné pour les animaux aux CSEh n'est pas évité. Au début du développement de nos lignées cellulaires, les chercheurs ont cultivé avec succès les CSEh sur des mangeoires humaines. Par la suite, Richards et ses collèges ont démontré que les mangeoires fœtales et adultes humaines favorisent la propagation indifférenciée prolongée des lignées de CSEh existantes et sont supérieures aux matrices acellulaires complétées par un milieu conditionné pour les humains ou les souris. Ils ont également rapporté la dérivation d'une nouvelle lignée de CSEh à l'aide de fibroblastes embryonnaires humains et de conditions de culture sans animaux (Richards et al., 2002). L'utilisation potentielle de placenta humain et de mangeoires dérivées du prépuce pour développer et soutenir la propagation indifférenciée des CSEh a également été démontrée (Genbacev et al., 2005 ; Amit et al., 2003).

Le maintien de cultures de CSEh indifférenciées en l'absence de mangeoires a été récemment rapporté. Il a été démontré que la combinaison du LIF, du facteur de croissance basique des fibroblastes et du facteur de croissance transformant Beta1 peut favoriser la prolifération indifférenciée des CSEh sur la fibronectine (Amit et al., 2004). L'activation du système de signalisation Wnt a également été suggérée pour favoriser le maintien des CSEh pluripotentes en l'absence de feeders (Sato et al., 2004). De plus, il a été suggéré que le remplacement du milieu par des concentrations élevées de FGF2 et de caboche est suffisant pour soutenir la propagation des CSEh sans mangeoires (Xu et al., 2005). De plus, une propagation indifférenciée sans alimentation de colonies de CSEh a été rapportée avec un milieu chimiquement défini sans substitut de sérum, complété par de l'activine ou du nodal plus FGF2 (Vallier et al., 2005). Enfin, la dérivation et la propagation des CSEh dans un système de culture sans animal, chimiquement défini et sans alimentation en présence de fortes concentrations de FGF2 ont été rapportées (Ludwig et al., 2006). Jusqu'à présent, le développement de CSEh dans des conditions qui permettront leur utilisation future pour la thérapie de transplantation n'a pas été signalé.

Dans la seconde moitié du projet, les chercheurs proposent de poursuivre nos efforts pour développer de nouvelles lignées de CSEh de qualité clinique entièrement dérivées de matières premières approuvées par la FDA dans un système de culture non animale.

Les nourrisseurs de souris seront remplacés par des lignées cellulaires primaires de fibroblastes humains. Dans la première partie du projet, les chercheurs ont achevé le développement de banques de cellules maîtresses (MCB) de nourrisseurs de fibroblastes humains de qualité clinique. Ces mangeoires ont été entièrement produites dans des conditions GMP au sein de l'installation de production de vecteurs Hadassah, en utilisant des matières premières sans animaux et approuvées par la FDA (pour plus de détails, voir la section Résultats). À notre connaissance, le développement de nourrisseurs humains de qualité clinique GMP n'a pas été signalé par d'autres groupes.

En parallèle, les chercheurs ont modifié les méthodes de dérivation et de culture des CSEh. Les chercheurs ont développé de nouvelles méthodes sans animaux pour l'isolement des cellules souches pluripotentes d'embryons humains de FIV et ont utilisé avec succès ces méthodes dans la dérivation de nouvelles lignées de CSEh. Le remplacement des produits animaux et des matériaux non approuvés par la FDA par des matériaux humanisés ou recombinants de qualité clinique dans le système de culture de CSEh est presque terminé. La validation de l'efficacité du système de culture modifié est en cours. Les résultats préliminaires suggèrent que le système de culture modifié peut soutenir efficacement la culture indifférenciée des CSEh.

Les lignées de CSEh de qualité clinique nouvellement dérivées seront dérivées d'embryons de couples entièrement sélectionnés conformément aux directives et réglementations en matière de don d'organes et de don de sang (conformément à la règle proposée par la FDA pour l'admissibilité des donneurs). Au cours de la première année, les enquêteurs ont achevé le recrutement de 14 embryons de trois couples. Les antécédents médicaux des donneurs ont été examinés et les résultats des analyses de sang et des écouvillonnages ont été obtenus et documentés. Des échantillons de sang du couple donneur ont été archivés pour des tests rétrospectifs dans une installation de stockage verrouillée. Le recrutement d'embryons supplémentaires est en cours.

Une fois la caractérisation et les tests de sécurité des nouveaux nourrisseurs humains terminés, leur extension en lots de travail et la validation de l'efficacité du système de culture de qualité clinique pour les CSEh, les chercheurs développeront les nouvelles lignées de CSEh dans la production de vecteurs de l'hôpital universitaire Hadassah. Installation, où un contrôle de qualité rigoureux et des tests environnementaux seront maintenus. Tous les travaux seront accomplis en utilisant uniquement des matières premières approuvées par notre programme d'assurance qualité, fournies par des fournisseurs qui ont subi un processus strict d'approbation/examen des fournisseurs. Le travail de production sera effectué en utilisant des techniques respectant les bonnes pratiques de fabrication (BPF) et les bonnes pratiques en matière de tissus (BTP).

Les CSEh et les nourrisseurs à passage précoce (Master Cell Bank) seront soumis à des tests phénotypiques et d'agents latents, à des analyses d'endotoxines et à des tests de contamination par des agents viraux et adventices. La banque de cellules de travail des nourrisseurs et des hESC sera également testée pour la caractérisation phénotypique, la reproductibilité, la stérilité et les mycoplasmes, la détection des agents latents et des endotoxines. Le produit final sera retesté conformément à la Master Cell Bank ci-dessus.

À la fin de notre processus de fabrication et de test, le programme de cellules souches d'Hadassah fournira un produit commercial générique. Les procédures et les méthodes que les chercheurs ont développées seront des outils instrumentaux pour d'autres chercheurs sur les cellules souches, ouvrant ainsi la voie à l'avenir de la recherche sur les cellules souches en Israël et dans le monde. Le potentiel commercial du produit permettra la production de cellules spécifiques à usage clinique ; ils auront une valeur commerciale étendue et auront une valeur marchande énorme.