Derivazione di nuove linee di cellule staminali embrionali umane per uso clinico

Le linee di cellule staminali embrionali (ES) derivano dalle cellule pluripotenti dell'embrione precoce. Le proprietà chiave delle cellule ES sono la loro capacità di proliferare indefinitamente in vitro senza differenziazione e la loro capacità di dare origine a tutte le cellule del corpo. La recente derivazione di linee cellulari ES da embrioni umani (Thomson et al., 1998; Reubinoff et al., 2000) attira un'attenzione significativa a causa del notevole potenziale di queste cellule per la ricerca scientifica di base, lo sviluppo di farmaci e la medicina rigenerativa.

Poiché le cellule staminali embrionali umane (hESC) sono in grado di auto-rinnovarsi illimitatamente e possono dare origine a qualsiasi cellula specializzata attraverso la differenziazione, possono potenzialmente essere utilizzate come fonte illimitata di donatori di cellule per il trapianto in una varietà di disturbi che derivano dalla perdita delle cellule o disfunzione cellulare. Tra queste condizioni c'è il morbo di Parkinson, la sclerosi multipla, la lesione traumatica del midollo spinale, il diabete, l'insufficienza cardiaca, l'insufficienza epatica, ecc.

È stato proposto che le caratteristiche essenziali delle cellule ES dei primati dovrebbero includere (i) derivazione dall'embrione preimpianto o periimpianto, (ii) proliferazione indifferenziata prolungata e (iii) potenziale di sviluppo stabile per formare derivati ​​di tutti e tre gli strati germinali anche dopo cultura prolungata (Thomson, 1996). I ricercatori hanno derivato linee di cellule staminali da embrioni umani precoci che soddisfano questi criteri (Reubinoff et al., 2000). Il nostro gruppo è stato il secondo al mondo a derivare linee hESC e il primo a mostrare il loro potenziale per subire la differenziazione somatica in vitro (Reubinoff et al., 2000).

Per sfruttare il notevole potenziale delle hESC, è necessario migliorare i metodi attualmente utilizzati per coltivare e manipolare le cellule, nonché controllarne la differenziazione. In questo contesto, i ricercatori hanno sviluppato nuovi approcci alla crioconservazione (Reubinoff et al., 2001), alla modifica genetica (Gropp et al., 2003; Ben-Dor et al., 2006) e al controllo della differenziazione delle cellule hESC ( Reubinoff et al., 2001, Itsykson et al., 2005).

Le linee cellulari ES umane sono derivate da embrioni prodotti mediante fecondazione in vitro (IVF) per scopi clinici. Gli embrioni congelati in eccesso che non sono più necessari per il trattamento dell'infertilità vengono reclutati a questo scopo dopo aver ottenuto il consenso informato del donatore e l'approvazione del comitato di revisione istituzionale/nazionale. Gli embrioni vengono scongelati e coltivati ​​allo stadio di blastocisti (5-6 giorni), la massa cellulare interna (ICM) composta da cellule pluripotenti viene isolata e le cellule staminali sono più comunemente coltivate sullo strato di cellule nutritrici di fibroblasti embrionali di topo. Lo strato di alimentazione è necessario per prevenire la differenziazione e promuovere la proliferazione delle cellule staminali.

La maggior parte delle linee hESC segnalate in tutto il mondo fino ad oggi e tutte le linee cellulari attualmente elencate nel registro NIH sono state derivate da strati di alimentazione di fibroblasti di topo. Le attuali linee non sarebbero idonee per l'uso clinico, in quanto lo screening dei donatori e dei reagenti non era conforme alla FDA e la presenza degli alimentatori di topi rende queste linee prodotti di xenotrapianto. I problemi di conformità normativa sollevati da queste linee rendono difficile ottenere l'approvazione della FDA per l'uso di trapianti umani.

Per eliminare l'uso di alimentatori di topi, gli hESC indifferenziati possono essere propagati con successo su superfici di plastica rivestite di laminina o Matrigel in presenza di terreno condizionato da fibroblasti embrionali di topo (Xu et al 2001). Mentre questo sistema evita il contatto diretto tra alimentatori di topi e hESC, non viene evitato il rischio di trasferimento incrociato di agenti patogeni animali dal mezzo condizionato dagli animali agli hESC. Durante i primi giorni di sviluppo delle nostre linee cellulari, i ricercatori hanno coltivato con successo le hESC su alimentatori umani. Successivamente, Richards e i suoi colleghi hanno dimostrato che gli alimentatori umani fetali e adulti supportano la propagazione indifferenziata prolungata delle linee hESC esistenti e sono superiori alle matrici prive di cellule integrate con terreno condizionato dall'alimentatore umano o di topo. Hanno anche riportato la derivazione di una nuova linea di hESC utilizzando fibroblasti embrionali umani e condizioni di coltura prive di animali (Richards et al., 2002). È stato anche dimostrato il potenziale utilizzo di placenta umana e alimentatori derivati ​​dal prepuzio per sviluppare e supportare la propagazione indifferenziata di hESC (Genbacev et al., 2005; Amit et al., 2003).

Recentemente è stato segnalato il mantenimento di colture di hESC indifferenziate in assenza di alimentatori. È stato dimostrato che la combinazione di LIF, fattore di crescita dei fibroblasti di base e fattore di crescita trasformante Beta1 può supportare la proliferazione indifferenziata di hESC sulla fibronectina (Amit et al., 2004). L'attivazione del sistema di segnalazione Wnt è stata anche suggerita per promuovere il mantenimento di hESC pluripotenti in assenza di alimentatori (Sato et al., 2004). Inoltre, è stato suggerito che la sostituzione del mezzo con alte concentrazioni di FGF2 e zucca sia sufficiente per supportare la propagazione di hESC senza alimentatori (Xu et al., 2005). Inoltre, è stata segnalata la propagazione indifferenziata senza alimentatore delle colonie di hESC con un mezzo definito chimicamente senza sostituto del siero, integrato con attivina o nodale più FGF2 (Vallier er al., 2005). Infine è stata segnalata la derivazione e la propagazione di hESC in un sistema di coltura privo di animali, definito chimicamente e privo di alimentatori in presenza di alte concentrazioni di FGF2 (Ludwig et al., 2006). Finora, non è stato segnalato lo sviluppo di hESC in condizioni che ne consentiranno l'uso futuro per la terapia del trapianto.

Nella seconda metà del progetto, i ricercatori propongono di continuare i nostri sforzi per sviluppare nuove linee hESC di livello clinico derivate totalmente da materie prime approvate dalla FDA in un sistema di coltura non animale.

I topi alimentatori saranno sostituiti con linee cellulari primarie di fibroblasti umani. Nella prima parte del progetto, i ricercatori hanno completato lo sviluppo di banche cellulari master (MCB) di alimentatori di fibroblasti umani di livello clinico. Questi alimentatori sono stati prodotti interamente in condizioni GMP all'interno dell'Hadassah Vector Production Facility, utilizzando materie prime prive di animali e approvate dalla FDA (per i dettagli vedere la sezione Risultati). Per quanto ne sappiamo, lo sviluppo di alimentatori umani di grado clinico GMP non è stato riportato da altri gruppi.

Parallelamente, i ricercatori hanno modificato i metodi per la derivazione e la coltura delle hESC. I ricercatori hanno sviluppato nuovi metodi privi di animali per l'isolamento delle cellule staminali pluripotenti da embrioni di fecondazione in vitro umana e hanno utilizzato con successo questi metodi nella derivazione di nuove linee hESC. La sostituzione dei prodotti animali e dei materiali non approvati dalla FDA con materiali umanizzati o ricombinanti di grado clinico nel sistema di coltura hESC è quasi completata. La convalida dell'efficacia del sistema di coltura modificato è in corso. I risultati preliminari suggeriscono che il sistema di coltura modificato può supportare in modo efficiente la coltivazione indifferenziata di hESC.

Le linee hESC di grado clinico appena derivate saranno derivate utilizzando embrioni di coppie interamente selezionate secondo le linee guida e le normative sulla donazione di organi e donazione di sangue (secondo la regola proposta dalla FDA per l'idoneità del donatore). Nel primo anno, i ricercatori hanno completato il reclutamento di 14 embrioni da tre coppie. Sono state riviste le anamnesi dei donatori e sono stati ottenuti e documentati i risultati dei test del sangue e dei tamponi. I campioni di sangue della coppia di donatori sono stati archiviati per i test retrospettivi in ​​un deposito chiuso a chiave. Il reclutamento di ulteriori embrioni è in corso.

Al termine della caratterizzazione e dei test di sicurezza dei nuovi alimentatori umani, espandendoli in lotti di lavoro e convalida dell'efficacia del sistema di coltura di grado clinico per hESC, i ricercatori svilupperanno le nuove linee hESC nell'Hadassah University Hospital Vector Production Struttura in cui verranno mantenuti severi controlli di qualità e test ambientali. Tutto il lavoro verrà realizzato utilizzando solo materie prime approvate dal nostro programma di garanzia della qualità, fornite da fornitori che sono stati sottoposti a un rigoroso processo di approvazione/revisione del fornitore. Il lavoro di produzione sarà eseguito utilizzando tecniche che aderiscono alle buone pratiche di fabbricazione (GMP) e alle buone pratiche dei tessuti (GTP).

Gli hESC e gli alimentatori a passaggio precoce (Master Cell Bank) saranno sottoposti a test fenotipici e di agenti latenti, analisi di endotossine e test per la contaminazione da agenti virali e avventizi. La Working Cell Bank sia degli alimentatori che delle hESC sarà anche testata per la caratterizzazione fenotipica, la riproducibilità, la sterilità e il micoplasma, il rilevamento di agenti latenti e le endotossine. Il prodotto finale sarà testato nuovamente come per la Master Cell Bank, sopra.

Alla conclusione del nostro processo di produzione e test, il programma sulle cellule staminali di Hadassah fornirà un prodotto commerciale generico. Le procedure ei metodi che i ricercatori hanno sviluppato saranno strumenti strumentali per altri ricercatori sulle cellule staminali, aprendo così la strada al futuro della ricerca sulle cellule staminali in Israele e nel mondo. Il potenziale commerciale del prodotto consentirà la produzione di cellule specifiche per uso clinico; avranno un valore commerciale diffuso e avranno un enorme valore di mercato.