임상용 신규 인간배아줄기세포주 유도

배아 줄기(ES) 세포주는 초기 배아의 다능성 세포에서 유래합니다. ES 세포의 주요 특성은 분화 없이 시험관 내에서 무한정 증식할 수 있는 능력과 신체의 모든 세포를 생성할 수 있는 능력입니다. 인간 배아에서 ES 세포주의 최근 파생(Thomson et al., 1998, Reubinoff et al., 2000)은 기초 과학 연구, 약물 개발 및 재생 의학을 위한 이러한 세포의 놀라운 잠재력으로 인해 상당한 관심을 끌고 있습니다.

인간 배아 줄기 세포(hESCs)는 무제한 자가 재생이 가능하고 분화를 통해 특수화된 세포를 생성할 수 있기 때문에 손실로 인해 발생하는 다양한 장애에서 이식을 위한 세포의 무제한 공여자 공급원으로 잠재적으로 사용될 수 있습니다. 세포 또는 세포 기능 장애. 이러한 상태 중에는 파킨슨병, 다발성 경화증, 외상성 척수 손상, 당뇨병, 심부전, 간부전 등이 있습니다.

영장류 ES 세포의 필수 특성에는 (i) 착상 전 또는 착상 주위 배아로부터 유래, (ii) 연장된 미분화 증식, 및 (iii) 이후에도 세 배 배엽 모두의 파생물을 형성할 수 있는 안정적인 발달 잠재력이 포함되어야 한다고 제안되었습니다. 장기 배양(Thomson, 1996). 연구자들은 이러한 기준을 충족하는 초기 인간 배아에서 줄기 세포주를 추출했습니다(Reubinoff et al., 2000). 우리 그룹은 세계에서 두 번째로 hESC 계통을 유도했으며, 체외에서 체세포 분화를 겪을 가능성을 처음으로 보여주었습니다(Reubinoff et al., 2000).

hESC의 놀라운 잠재력을 활용하기 위해서는 현재 사용되는 세포 배양 및 조작 방법과 분화 조절 방법의 개선이 필요합니다. 이러한 맥락에서 조사자들은 hESCs 세포의 분화를 제어하고(Gropp et al., 2003; Ben-Dor et al., 2006), 저온 보존(Reubinoff et al., 2001)에 대한 새로운 접근 방식을 개발했습니다. Reubinoff 등, 2001, Itsykson 등, 2005).

인간 ES 세포주는 임상 목적을 위해 체외 수정(IVF)에 의해 생산된 배아에서 유래합니다. 더 이상 불임 치료에 필요하지 않은 잉여 냉동 배아는 기증자 사전 동의 및 기관/국가 검토 위원회 승인을 얻은 후 이 목적을 위해 모집됩니다. 배아를 해동하여 배반포기(5-6일)까지 배양하고, 다능성 세포로 구성된 내세포괴(inner cell mass, ICM)를 분리하여 줄기세포를 마우스 배아 섬유아세포 지지세포층에서 가장 많이 배양한다. 피더층은 분화를 방지하고 줄기세포의 증식을 촉진하기 위해 필요합니다.

지금까지 전 세계적으로 보고된 대부분의 hESC 라인과 현재 NIH 레지스트리에 나열된 모든 셀 라인은 마우스 섬유아세포 영양층에서 파생되었습니다. 현재 라인은 기증자와 시약의 스크리닝이 FDA를 준수하지 않았고 마우스 피더의 존재로 인해 이러한 라인이 이종이식 제품이 되었기 때문에 임상 사용에 적합하지 않습니다. 이러한 라인이 제기하는 규제 준수 문제로 인해 인간 이식 사용에 대한 FDA 승인을 얻기가 어렵습니다.

마우스 피더의 사용을 제거하기 위해, 미분화 hESC는 마우스 배아 섬유아세포 조절 배지의 존재 하에 라미닌 또는 Matrigel 코팅된 플라스틱 표면에서 성공적으로 증식될 수 있습니다(Xu et al 2001). 이 시스템은 마우스 피더와 hESC 사이의 직접적인 접촉을 피하지만, 동물 조절 배지에서 hESC로 동물 병원균의 교차 전이 위험을 피할 수 없습니다. 세포주 개발 초기에 조사자들은 인간 피더에서 hESC를 성공적으로 배양했습니다. 그 후, Richards와 그의 대학은 인간 태아 및 성인 피더가 기존 hESC 라인의 연장된 미분화 번식을 지원하고 인간 또는 마우스 피더 조절 배지로 보충된 무세포 매트릭스보다 우수함을 입증했습니다. 그들은 또한 인간 배아 섬유아세포와 동물이 없는 배양 조건을 사용하여 새로운 hESC 계열의 유도를 보고했습니다(Richards et al., 2002). hESC의 미분화 번식을 개발하고 지원하기 위한 인간 태반 및 포피 유래 영양 공급 장치의 잠재적 사용도 입증되었습니다(Genbacev et al., 2005; Amit et al., 2003).

피더가 없는 미분화 hESC의 배양 유지가 최근에 보고되었습니다. LIF, 기본 섬유아세포 성장 인자 및 변형 성장 인자 Beta1의 조합이 피브로넥틴에서 hESC의 미분화 증식을 지원할 수 있음이 밝혀졌습니다(Amit et al., 2004). Wnt 신호 시스템의 활성화는 또한 피더가 없을 때 다능성 hESC의 유지를 촉진하는 것으로 제안되었습니다(Sato et al., 2004). 또한, 고농도의 FGF2 및 noggin으로 배지를 대체하는 것이 피더 없이 hESC의 번식을 지원하기에 충분하다는 것이 제안되었습니다(Xu et al., 2005). 또한, hESCs 콜로니의 피더가 없는 미분화 증식은 혈청 대체제 없이 화학적으로 정의된 배지, 액티빈 또는 결절 플러스 FGF2로 보충된 것으로 보고되었습니다(Vallier er al., 2005). 마지막으로 고농도의 FGF2 존재 하에 동물이 없고, 화학적으로 규정된, 영양 공급 장치가 없는 배양 시스템에서 hESC의 유도 및 증식이 보고되었다(Ludwig et al., 2006). 지금까지 이식 요법을 위한 향후 사용을 허용할 조건 하에서 hESC의 개발은 보고되지 않았습니다.

프로젝트의 후반부에서 조사관은 비동물 배양 시스템에서 FDA 승인 원료로부터 완전히 파생된 새로운 임상 등급 hESC 라인을 개발하기 위한 노력을 계속할 것을 제안합니다.

마우스 피더는 인간 섬유아세포의 1차 세포주로 대체됩니다. 프로젝트의 첫 번째 부분에서 연구자들은 임상 등급의 인간 섬유아세포 피더의 마스터 세포 은행(MCB) 개발을 완료했습니다. 이 피더는 동물이 없는 FDA 승인 원료를 사용하여 Hadassah Vector Production Facility 내의 GMP 조건에서 완전히 생산되었습니다(자세한 내용은 결과 섹션 참조). 우리가 아는 한, GMP 임상 등급 인간 영양 공급 장치의 개발은 다른 그룹에서 보고되지 않았습니다.

동시에 연구자들은 hESCs의 유도 및 배양 방법을 수정했습니다. 연구자들은 인간 IVF 배아에서 다능성 줄기 세포를 분리하기 위해 동물을 사용하지 않는 새로운 방법을 개발했으며 이러한 방법을 새로운 hESC 계통의 유도에 성공적으로 사용했습니다. hESC 배양 시스템에서 동물 제품 및 FDA 비승인 물질을 인간화 또는 재조합 임상 등급 물질로 대체하는 작업이 거의 완료되었습니다. 수정된 배양 시스템의 효능에 대한 검증이 진행 중입니다. 예비 결과는 수정된 배양 시스템이 hESC의 미분화 배양을 효율적으로 지원할 수 있음을 시사합니다.

새로 파생된 임상 등급 hESC 라인은 장기 기증 및 헌혈 가이드라인 및 규정(기증자 적합성에 대한 FDA 제안 규칙에 따름)에 따라 전체적으로 선별된 부부의 배아를 사용하여 파생될 것입니다. 첫 해에 연구자들은 세 커플의 배아 14개 모집을 완료했습니다. 기증자의 병력을 검토하고 선별 혈액 및 면봉 검사 결과를 얻어 문서화했습니다. 기증자 부부 혈액 샘플은 후향적 테스트를 위해 잠긴 보관 시설에 보관되었습니다. 추가 배아 모집이 진행 중입니다.

새로운 인간 피더의 특성화 및 안전성 테스트가 완료되고 작업 로트로 확장되고 hESC에 대한 임상 등급 배양 시스템의 효능이 검증되면 조사관은 Hadassah 대학 병원 벡터 생산에서 새로운 hESC 라인을 개발할 것입니다. 엄격한 품질 관리 및 환경 테스트가 유지되는 시설. 모든 작업은 엄격한 공급업체 승인/검토 프로세스를 거친 공급업체가 제공하는 품질 보증 프로그램에서 승인한 원자재만을 사용하여 수행됩니다. 생산 작업은 GMP(Good Manufacturing Practice) 및 GTP(Good Tissue Practice)를 준수하는 기술을 사용하여 수행됩니다.

초기 계대 hESC 및 피더(마스터 세포 은행)는 표현형 및 잠재성 인자 테스트, 내독소 분석 및 바이러스 및 외래성 인자 오염 테스트를 위해 제출됩니다. 피더 및 hESC 모두의 작업 세포 은행은 또한 표현형 특성화, 재현성, 무균성 및 마이코플라스마, 잠재 인자의 검출 및 내독소에 대해 테스트될 것입니다. 최종 제품은 위의 마스터 셀 뱅크에 따라 다시 테스트됩니다.

당사의 제조 및 테스트 프로세스가 완료되면 Hadassah의 줄기 세포 프로그램은 일반 상용 제품을 제공할 것입니다. 연구자들이 개발한 절차와 방법은 다른 줄기 세포 연구자들에게 중요한 도구가 될 것이며, 따라서 이스라엘과 전 세계에서 줄기 세포 연구의 미래를 위한 길을 닦을 것입니다. 제품의 상업적 잠재력은 임상용 특정 세포의 생산을 가능하게 할 것입니다. 그들은 광범위한 상업적 가치를 가질 것이며 엄청난 시장 가치가 있을 것입니다.