Wyprowadzenie linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do użytku klinicznego

Embrionalne linie komórek macierzystych (ES) pochodzą z pluripotencjalnych komórek wczesnego zarodka. Kluczowe właściwości komórek ES to ich zdolność do nieskończonej proliferacji in vitro bez różnicowania oraz zdolność do tworzenia wszystkich komórek organizmu. Niedawne wyprowadzenie linii komórek ES z ludzkich embrionów (Thomson i in., 1998, Reubinoff i in., 2000) przyciąga znaczną uwagę ze względu na niezwykły potencjał tych komórek w podstawowych badaniach naukowych, opracowywaniu leków i medycynie regeneracyjnej.

Ponieważ ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) są zdolne do nieograniczonej samoodnawiania i mogą dać początek dowolnej wyspecjalizowanej komórce poprzez różnicowanie, mogą potencjalnie być wykorzystywane jako nieograniczone źródło komórek dawców do przeszczepów w różnych zaburzeniach wynikających z utraty komórek lub dysfunkcji komórkowych. Wśród tych stanów jest choroba Parkinsona, stwardnienie rozsiane, urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego, cukrzyca, niewydolność serca, niewydolność wątroby itp.

Zaproponowano, aby podstawowe cechy komórek ES naczelnych obejmowały (i) pochodzenie z zarodka przedimplantacyjnego lub okołoimplantacyjnego, (ii) przedłużoną niezróżnicowaną proliferację oraz (iii) stabilny potencjał rozwojowy do tworzenia pochodnych wszystkich trzech zarodkowych listków zarodkowych nawet po przedłużona kultura (Thomson, 1996). Badacze wyprowadzili linie komórek macierzystych z wczesnych embrionów ludzkich, które spełniają te kryteria (Reubinoff i in., 2000). Nasza grupa była drugą na świecie, która wyprowadziła linie hESC i pierwszą, która wykazała ich potencjał do różnicowania somatycznego in vitro (Reubinoff i in., 2000).

Wykorzystanie niezwykłego potencjału hESC wymaga udoskonalenia obecnie stosowanych metod hodowli i manipulacji komórkami oraz kontroli ich różnicowania. W tym kontekście badacze opracowali nowe podejście do kriokonserwacji (Reubinoff i in., 2001), modyfikacji genetycznej (Gropp i in., 2003; Ben-Dor i in., 2006) oraz do kontrolowania różnicowania komórek hESC ( Reubinoff i in., 2001, Itsykson i in., 2005).

Ludzkie linie komórkowe ES pochodzą z embrionów wyprodukowanych przez zapłodnienie in vitro (IVF) do celów klinicznych. Nadwyżki zamrożonych zarodków, które nie są już potrzebne do leczenia niepłodności, rekrutuje się w tym celu po uzyskaniu świadomej zgody dawcy i uzyskaniu zgody instytucjonalnej/krajowej komisji rewizyjnej. Zarodki rozmraża się i hoduje do stadium blastocysty (5-6 dni), izoluje się wewnętrzną masę komórkową (ICM) złożoną z komórek pluripotencjalnych, a komórki macierzyste hoduje się najczęściej na warstwie komórek odżywczych fibroblastów embrionalnych myszy. Warstwa odżywiająca jest wymagana do zapobiegania różnicowaniu i promowania proliferacji komórek macierzystych.

Większość linii hESC zgłoszonych do tej pory na całym świecie i wszystkie linie komórkowe obecnie wymienione w rejestrze NIH pochodziły z warstw odżywczych mysich fibroblastów. Obecne linie nie nadawałyby się do użytku klinicznego, ponieważ badania przesiewowe dawców i odczynników nie były zgodne z FDA, a obecność karmników dla myszy czyni te linie produktami ksenotransplantacyjnymi. Kwestie zgodności z przepisami, które poruszają te linie, utrudniają uzyskanie zgody FDA na stosowanie przeszczepów u ludzi.

Aby wyeliminować stosowanie karmników dla myszy, niezróżnicowane komórki hESC można z powodzeniem rozmnażać na plastikowych powierzchniach pokrytych lamininą lub Matrigelem w obecności pożywki kondycjonowanej embrionalnymi fibroblastami myszy (Xu i in. 2001). Chociaż system ten pozwala uniknąć bezpośredniego kontaktu między karmnikami myszy a komórkami hESC, nie można uniknąć ryzyka przenoszenia patogenów zwierzęcych z pożywki kondycjonowanej przez zwierzęta do komórek hESC. We wczesnych dniach opracowywania naszych linii komórkowych badacze z powodzeniem hodowali komórki hESC na ludzkich żywicielach. Następnie Richards i jego kolegia wykazali, że karmniki dla ludzkich płodów i dorosłych wspierają przedłużoną niezróżnicowaną propagację istniejących linii hESC i są lepsze niż macierze bezkomórkowe uzupełnione pożywką kondycjonowaną dla ludzi lub myszy. Zgłosili również wyprowadzenie nowej linii hESC przy użyciu ludzkich embrionalnych fibroblastów i warunków hodowli wolnych od zwierząt (Richards i in., 2002). Wykazano również potencjalne zastosowanie ludzkiego łożyska i pokarmów pochodzących z napletka do rozwoju i wspierania niezróżnicowanej propagacji hESC (Genbacev i in., 2005; Amit i in., 2003).

Niedawno doniesiono o utrzymaniu hodowli niezróżnicowanych hESC pod nieobecność żywicieli. Wykazano, że połączenie LIF, podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów i transformującego czynnika wzrostu Beta1 może wspierać niezróżnicowaną proliferację hESC na fibronektynie (Amit i in., 2004). Zasugerowano również aktywację systemu sygnalizacji Wnt w celu promowania utrzymania pluripotencjalnych komórek hESC przy braku substancji odżywczych (Sato i in., 2004). Ponadto zasugerowano, że zastąpienie pożywki wysokimi stężeniami FGF2 i noggin jest wystarczające do wspierania propagacji hESC bez żywicieli (Xu i in., 2005). Ponadto odnotowano niezróżnicowane rozmnażanie kolonii hESC bez substancji odżywczych z chemicznie zdefiniowaną pożywką bez substytutu surowicy, uzupełnioną aktywiną lub węzłem plus FGF2 (Vallier i in., 2005). Na koniec opisano pochodzenie i namnażanie hESC w wolnym od zwierząt, chemicznie zdefiniowanym, wolnym od substancji odżywczych systemie hodowli w obecności wysokich stężeń FGF2 (Ludwig i in., 2006). Jak dotąd nie odnotowano rozwoju hESC w warunkach, które umożliwią jego przyszłe zastosowanie w terapii transplantacyjnej.

W drugiej połowie projektu badacze proponują kontynuowanie naszych wysiłków w celu opracowania nowych linii hESC klasy klinicznej, pochodzących całkowicie z surowców zatwierdzonych przez FDA w systemie hodowli bez udziału zwierząt.

Karmniki dla myszy zostaną zastąpione pierwotnymi liniami komórkowymi ludzkich fibroblastów. W pierwszej części projektu badacze zakończyli opracowywanie banków macierzystych (MCB) ludzkich fibroblastów o jakości klinicznej. Te karmniki zostały wyprodukowane w całości zgodnie z warunkami GMP w zakładzie produkcji wektorów Hadassah, przy użyciu surowców niezawierających zwierząt, zatwierdzonych przez FDA (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji Wyniki). Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, inne grupy nie zgłosiły rozwoju karmników dla ludzi klasy klinicznej GMP.

Równolegle badacze zmodyfikowali metody pozyskiwania i hodowli komórek hESC. Badacze opracowali nowe, wolne od zwierząt metody izolacji pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich zarodków IVF iz powodzeniem wykorzystali te metody do uzyskania nowych linii hESC. Zastępowanie produktów zwierzęcych i niezatwierdzonych przez FDA materiałów humanizowanymi lub rekombinowanymi materiałami klasy klinicznej w systemie hodowli hESC jest bliskie zakończenia. Walidacja skuteczności zmodyfikowanego systemu hodowli jest w toku. Wstępne wyniki sugerują, że zmodyfikowany system hodowli może skutecznie wspierać niezróżnicowaną hodowlę hESC.

Nowo powstałe linie hESC klasy klinicznej zostaną uzyskane przy użyciu zarodków od par całkowicie przebadanych zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi dawstwa narządów i krwiodawstwa (zgodnie z proponowaną przez FDA zasadą przydatności dawcy). W pierwszym roku badacze zakończyli rekrutację 14 embrionów z trzech par. Dokonano przeglądu historii medycznej dawców oraz uzyskano i udokumentowano wyniki przesiewowych badań krwi i wymazów. Próbki krwi par dawców zostały zarchiwizowane do badań retrospektywnych w zamkniętym magazynie. Trwa rekrutacja dodatkowych zarodków.

Po zakończeniu charakteryzacji i testów bezpieczeństwa nowych karmników dla ludzi, rozszerzeniu ich na partie robocze i potwierdzeniu skuteczności systemu hodowli na poziomie klinicznym dla hESC, badacze opracują nowe linie hESC w produkcji wektorów szpitala uniwersyteckiego Hadassah Obiekt, w którym utrzymana zostanie rygorystyczna kontrola jakości i badania środowiskowe. Wszystkie prace zostaną wykonane przy użyciu wyłącznie surowców zatwierdzonych przez nasz Program Zapewnienia Jakości, dostarczonych przez dostawców, którzy przeszli rygorystyczny proces zatwierdzania/przeglądu dostawców. Prace produkcyjne będą wykonywane przy użyciu technik zgodnych z dobrymi praktykami wytwarzania (GMP) i dobrymi praktykami tkankowymi (GTP).

Wczesne pasażowane komórki hESC i komórki uzupełniające (Master Cell Bank) zostaną poddane testom fenotypowym i czynnikom utajonym, analizie endotoksyn oraz testom na zanieczyszczenie wirusami i czynnikami przypadkowymi. Roboczy bank komórek zarówno komórek karmiących, jak i komórek hESC zostanie również przetestowany pod kątem charakterystyki fenotypowej, odtwarzalności, sterylności i mykoplazmy, wykrywania utajonych czynników i endotoksyn. Produkt końcowy zostanie ponownie przetestowany zgodnie z powyższym bankiem komórek macierzystych.

Na zakończenie naszego procesu produkcyjnego i testowego program komórek macierzystych firmy Hadassah dostarczy generyczny produkt komercyjny. Procedury i metody, które opracowali badacze, będą instrumentalnymi narzędziami dla innych badaczy komórek macierzystych, torując w ten sposób drogę dla przyszłych badań nad komórkami macierzystymi w Izraelu i na świecie. Potencjał komercyjny produktu pozwoli na produkcję specyficznych komórek do użytku klinicznego; będą miały powszechną wartość handlową i będą miały ogromną wartość rynkową.