Virus du papillome humain sur les tissus buccaux, la salive et le sérum (CDHPOTSS)

Cette étude sera réalisée au centre de cancérologie buccale de l'UNESP et a impliqué quarante patients (n = 40) et quarante témoins. Les échantillons de sérum, les écouvillons oraux et la salive seront prélevés à la date du diagnostic avant le traitement et seront conservés à -80 ºC jusqu'à l'analyse. Les tissus de carcinome épidermoïde oral inclus dans la paraffine fixés au formol et d'autres échantillons biologiques seront traités avec la méthode d'extraction au phénol/chloroforme.

Les tumeurs de 40 patients OSCC à l'Université UNESP seront obtenues par biopsie avec consentement préalable, ainsi que les échantillons correspondants de sang de ponction veineuse, de salive et de cellules buccales exfoliées. A partir des contrôles seront obtenus tous les échantillons à l'exception des tissus de biopsie. Les informations cliniques, y compris l'emplacement de la tumeur, le stade et l'état ganglionnaire, seront enregistrées.

Les échantillons de sang coagulé seront centrifugés à basse vitesse pendant 5 min, et le sérum a été stocké à - 80 °C avant l'extraction de l'ADN. Des échantillons de sérum (400 ml) seront utilisés pour l'extraction de l'ADN. La salive entière et les cellules buccales exfoliées seront digérées dans la protéinase K à 48 °C pendant deux heures, les échantillons de sérum et de tissu tumoral seront digérés dans la protéinase K à 48 °C pendant la nuit, suivis d'une extraction au phénol/chloroforme et d'une précipitation à l'éthanol de l'ADN pour tous échantillons. Après remise en suspension dans 50 ml d'eau distillée, les concentrations moyennes d'ADN de travail seront de 100 à 150 ng/ml par échantillons de sérum et de tissus et de 30 à 50 ng/ml par échantillon de salive entière et de cellules buccales exfoliées. Pour la bêta-globine PCR on utilisera 150 à 300 ng d'ADN cellulaire total purifié, pour évaluer la qualité de l'ADN à l'aide des amorces PCR GH20 et PC04. Après confirmation de la présence et de l'intégrité de l'ADN génomique humain, la même quantité d'ADN sera testée pour l'ADN du VPH par réaction en chaîne par polymérase (PCR) nichée dans tous les échantillons. Dans le premier tour de PCR, les amorces consensus dégénérées MY11 et MY09 seront utilisées pour amplifier des fragments de 450 pb. L'ADN du VPH sera amplifié dans un second tour par les ensembles d'amorces GP5+ et GP6+. Les autres composants de la réaction seront : 10,9 microlitres d'eau ultra-pure, 2,5 microlitres de tampon PCR 10X, 4 mM de MgCl2, 15 pmol de dNTP et 1 unité d'ADN polymérase Platinum Taq. Environ 150 à 300 ng d'ADN génomique de chaque échantillon seront ajoutés au mélange. La même quantité de cellules Hela, avec jusqu'à 4 copies de HPV-18 par cellule, sera utilisée comme témoin positif pour l'infection par le HPV. Le contrôle négatif sera composé de tous les composants de la PCR à l'exception de l'ADN. Le mélange a subi une dénaturation initiale à 94°C pendant 10 min, avant 40 cycles de PCR (94°C pendant 1 min ; 55°C pendant 1 min ; 72°C pendant 40) et 72°C pendant 4 minutes. Pour la nPCR, deux microlitres du produit de la première réaction seront utilisés directement dans une réaction contenant : 0,02 mM de chaque amorce GP5+ et GP6+ (Invitrogen Life Technologies®, Brésil), qui produisent un fragment d'ADN de 150 pb. Les composants et les conditions de réaction restants seront tels que décrits pour le premier cycle de PCR, à l'exception de la température d'hybridation qui sera réduite à 43 °C. Dix microlitres des produits de nPCR seront fractionnés par électrophorèse dans un gel de polyacrylamide à 8 %, pendant 3 heures à 100 volts. La visualisation des bandes sera réalisée par coloration avec une solution de nitrate d'argent. Les échantillons seront notés comme étant positifs ou négatifs pour l'ADN du VPH sur la base de l'inspection des bandes colorées au nitrate d'argent. L'amplification par PCR sera réalisée en triple pour chaque échantillon. Les échantillons seront classés comme positifs ou négatifs en fonction de l'analyse du gel.

Les différences de proportion seront évaluées au moyen du test exact de Fisher. Une valeur P inférieure à 0,05 sera considérée comme statistiquement significative. Ces calculs statistiques seront effectués à l'aide de SPSS, version 10.0, pour Windows.