Вирус папилломы человека на тканях полости рта, слюне и сыворотке (CDHPOTSS)

Это исследование будет проведено в Центре буккального рака UNESP с участием сорока пациентов (n = 40) и сорока контрольных. Образцы сыворотки, оральные мазки и слюна собираются в день постановки диагноза перед терапией и хранятся при температуре -80 ºC до проведения анализа. Ткани плоскоклеточной карциномы полости рта, фиксированные формалином и залитые в парафин, и другие биологические образцы обрабатывают методом экстракции фенолом/хлороформом.

Опухоли от 40 пациентов с OSCC в Университете UNESP будут получены путем биопсии с предварительного согласия, а также соответствующей венепункции крови, сбора слюны и образцов эксфолиированных буккальных клеток. Из контролей будут получены все образцы, кроме биопсийных тканей. Будет записана клиническая информация, включая расположение опухоли, стадию и статус узла.

Образцы свернувшейся крови центрифугируют на низкой скорости в течение 5 минут, а сыворотку перед выделением ДНК хранят при температуре -80 °C. Образцы сыворотки (400 мл) будут использованы для выделения ДНК. Целая слюна и отслоившиеся буккальные клетки будут расщеплены протеиназой К при 48°С в течение двух часов, образцы сыворотки и опухолевой ткани будут расщеплены протеиназой К при 48°С в течение ночи с последующей экстракцией фенолом/хлороформом и осаждением ДНК этанолом для всех образцы. После ресуспендирования в 50 мл дистиллированной воды средние рабочие концентрации ДНК составят 100-150 нг/мл на образцы сыворотки и тканей и 30-50 нг/мл на образцы цельной слюны и эксфолиированных клеток щеки. Для бета-глобиновой ПЦР будет использоваться от 150 до 300 нг очищенной общей клеточной ДНК, для оценки качества ДНК с использованием праймеров для ПЦР GH20 и PC04. После подтверждения наличия и целостности геномной ДНК человека такое же количество ДНК будет тестироваться на ДНК ВПЧ методом вложенной полимеразной цепной реакции (ПЦР) во всех образцах. В первом раунде ПЦР будут использоваться вырожденные консенсусные праймеры MY11 и MY09 для амплификации фрагментов размером 450 п.н. ДНК ВПЧ будет амплифицирована во втором раунде наборами праймеров GP5+ и GP6+. Другими компонентами реакции будут: 10,9 мкл сверхчистой воды, 2,5 мкл ПЦР-буфера 10X, 4 мМ MgCl2, 15 пмоль dNTP и 1 единица ДНК-полимеразы Platinum Taq. К смеси добавляют примерно 150-300 нг геномной ДНК из каждого образца. Такое же количество клеток Hela, содержащих до 4 копий ВПЧ-18 на клетку, будет использоваться в качестве положительного контроля для инфекции ВПЧ. Отрицательный контроль будет состоять из всех компонентов ПЦР, кроме ДНК. Смесь подвергалась начальной денатурации до 94°С в течение 10 мин, перед 40 циклами ПЦР (94°С в течение 1 мин; 55°С в течение 1 мин; 72°С в течение 40) и 72°С в течение 4 минут. Для нПЦР два микролитра продукта из первой реакции будут использованы непосредственно в реакции, содержащей: по 0,02 мМ каждого праймера GP5+ и GP6+ (Invitrogen Life Technologies®, Бразилия), которые продуцируют фрагмент ДНК размером 150 п.о. Остальные компоненты реакции и условия будут такими же, как описано для первого раунда ПЦР, за исключением температуры отжига, которая будет снижена до 43ºC. Десять микролитров продуктов nPCR будут фракционированы электрофорезом в 8% полиакриламидном геле в течение 3 часов при 100 вольт. Визуализацию полос проводят путем окрашивания раствором нитрата серебра. Образцы будут оцениваться как положительные или отрицательные по ДНК ВПЧ на основании анализа полос, окрашенных нитратом серебра. ПЦР-амплификация будет проводиться в трех повторностях для каждого образца. Образцы будут классифицированы как положительные или отрицательные на основе анализа геля.

Различия в пропорциях будут оцениваться с помощью точного критерия Фишера. Значение P менее 0,05 будет считаться статистически значимым. Эти статистические расчеты будут выполняться с использованием SPSS версии 10.0 для Windows.