Humant papillomavirus på oralt væv, spyt og serum (CDHPOTSS)

Denne undersøgelse vil blive foretaget i det bukkale cancercenter hos UNESP og involveret fyrre patienter (n = 40) og fyrre kontroller. Serumprøver, orale podninger og spyt opsamles på diagnosetidspunktet før behandling og opbevares ved -80 ºC indtil analyse. Formalinfikserede paraffinindlejrede orale pladecellecarcinomvæv og andre biologiske prøver behandles med phenol/chloroform-ekstraktionsmetoden.

Tumorer fra 40 OSCC-patienter ved UNESP University vil blive opnået fra biopsi med forudgående samtykke, sammen med tilsvarende venepunktur-blod, spytopsamling og eksfolierede bukkale celler. Fra kontroller vil blive indhentet alle prøver undtagen biopsivæv. Klinisk information, herunder tumorplacering, stadium og nodalstatus vil blive registreret.

Koagulerede blodprøver vil blive centrifugeret ved lav hastighed i 5 minutter, og serumet blev opbevaret ved -80 °C før DNA-ekstraktion. Serumprøver (400 ml) vil blive brugt til DNA-ekstraktion. Hele spyt og eksfolierede buccale celler vil blive fordøjet i proteinase K ved 48°C i løbet af to timer, serum- og tumorvævsprøver vil blive fordøjet i proteinase K ved 48°C natten over, efterfulgt af phenol/chloroform-ekstraktion og ethanoludfældning af DNA for alle prøver. Efter resuspension i 50 ml destilleret vand vil de gennemsnitlige arbejds-DNA-koncentrationer være 100-150 ng/ml pr. serum- og vævsprøver og 30-50 ng/ml pr. hel spyt- og eksfolierede bukkale celleprøver. Til beta-globin PCR vil der blive brugt 150 til 300 ng oprenset total cellulært DNA for at vurdere kvaliteten af ​​DNA'et ved hjælp af PCR-primerne GH20 og PC04. Efter bekræftelse af tilstedeværelsen og integriteten af ​​genomisk humant DNA vil den samme mængde DNA blive testet for HPV-DNA ved nestet polymerasekædereaktion (PCR) i alle prøver. I den første PCR-runde vil degenererede konsensusprimere MY11 og MY09 blive brugt til at amplificere fragmenter på 450 bp. HPV DNA vil amplificeres i en anden runde af GP5+ og GP6+ primersæt. De øvrige reaktionskomponenter vil være: 10,9 mikroliter ultrarent vand, 2,5 mikroliter PCR-buffer 10X, 4mM MgCl2, 15 pmol dNTP'er og 1 enhed Platinum Taq DNA-polymerase. Ca. 150-300 ng genomisk DNA fra hver prøve vil blive tilsat til blandingen. Den samme mængde Hela-celler, med op til 4 kopier af HPV-18 pr. celle, vil blive brugt som positiv kontrol for HPV-infektion. Den negative kontrol vil være sammensat af alle PCR-komponenter undtagen DNA. Blandingen gennemgik indledende denaturering til 94ºC i 10 minutter før 40 PCR-cyklusser (94ºC i 1 min; 55ºC i 1 min; 72ºC i 40) og 72ºC i 4 minutter. Til nPCR vil to mikroliter af produktet fra den første reaktion blive brugt direkte i en reaktion indeholdende: 0,02 mM af hver primer GP5+ og GP6+ (Invitrogen Life Technologies®, Brasilien), som producerer et 150 pb DNA-fragment. De resterende reaktionskomponenter og -betingelser vil være som beskrevet for den første PCR-runde, bortset fra annealingstemperaturen, der vil blive reduceret til 43ºC. Ti mikroliter af nPCR-produkterne vil blive fraktioneret ved elektroforese i en 8% polyacrylamidgel i 3 timer ved 100 volt. Båndvisualisering vil blive udført ved farvning med sølvnitratopløsning. Prøver vil blive bedømt som enten HPV DNA-positive eller negative baseret på inspektion af sølvnitratfarvede bånd. PCR-amplifikation vil blive udført i triplikater for hver prøve. Prøver vil blive klassificeret som positive eller negative baseret på gelanalyse.

Forskelle i forhold vil blive vurderet ved hjælp af Fishers eksakte test. En P-værdi på mindre end 0,05 vil blive betragtet som statistisk signifikant. Disse statistiske beregninger vil blive udført ved hjælp af SPSS, version 10.0, til Windows.