Virus del Papiloma Humano en Tejido Oral, Saliva y Suero (CDHPOTSS)

Este estudio se realizará en el centro de cáncer bucal de la UNESP e involucró a cuarenta pacientes (n = 40) y cuarenta controles. Las muestras de suero, hisopos orales y saliva se recolectarán en la fecha del diagnóstico antes de la terapia y se almacenarán a -80 ºC hasta el análisis. Los tejidos de carcinoma de células escamosas orales fijados con formalina e incluidos en parafina y otras muestras biológicas se procesarán con el método de extracción con fenol/cloroformo.

Los tumores de 40 pacientes con OSCC de la Universidad de la UNESP se obtendrán mediante biopsia con consentimiento previo, junto con las correspondientes muestras de sangre de venopunción, recolección de saliva y células bucales exfoliadas. De los controles se obtendrán todas las muestras excepto los tejidos de biopsia. Se registrará la información clínica, incluida la ubicación del tumor, el estadio y el estado de los ganglios.

Las muestras de sangre coagulada se centrifugarán a baja velocidad durante 5 min y el suero se almacenará a -80 °C antes de la extracción de ADN. Se utilizarán muestras de suero (400 ml) para la extracción de ADN. La saliva entera y las células bucales exfoliadas se digerirán en proteinasa K a 48 °C durante dos horas, las muestras de suero y tejido tumoral se digerirán en proteinasa K a 48 °C durante la noche, seguido de extracción con fenol/cloroformo y precipitación de ADN con etanol para todas las muestras. muestras Después de la resuspensión en 50 ml de agua destilada, las concentraciones medias de ADN de trabajo serán de 100-150 ng/ml por muestras de suero y tejidos y de 30-50 ng/ml por muestras de saliva entera y células bucales exfoliadas. Para la PCR de beta-globina se utilizarán de 150 a 300 ng de ADN celular total purificado, para evaluar la calidad del ADN utilizando los cebadores de PCR GH20 y PC04. Después de confirmar la presencia y la integridad del ADN genómico humano, se analizará la misma cantidad de ADN para detectar el ADN del VPH mediante la reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR) en todas las muestras. En la primera ronda de PCR, se utilizarán los cebadores de consenso degenerados MY11 y MY09 para amplificar fragmentos de 450 pb. El ADN del VPH se amplificará en una segunda ronda mediante conjuntos de cebadores GP5+ y GP6+. Los demás componentes de la reacción serán: 10,9 microlitros de agua ultrapura, 2,5 microlitros de tampón de PCR 10X, MgCl2 4 mM, 15 pmol de dNTP y 1 unidad de ADN polimerasa Platinum Taq. Se agregarán a la mezcla aproximadamente 150-300 ng de ADN genómico de cada muestra. La misma cantidad de células Hela, con hasta 4 copias de HPV-18 por célula, se utilizará como control positivo para la infección por HPV. El control negativo estará compuesto por todos los componentes de la PCR excepto el ADN. La mezcla se desnaturalizó inicialmente a 94ºC por 10 min, antes de 40 ciclos de PCR (94ºC por 1 min; 55ºC por 1 min; 72ºC por 40) y 72°C por 4 minutos. Para nPCR, se utilizarán dos microlitros del producto de la primera reacción directamente en una reacción que contiene: 0,02 mM de cada cebador GP5+ y GP6+ (Invitrogen Life Technologies®, Brasil), que producen un fragmento de ADN de 150 pb. El resto de componentes y condiciones de la reacción serán los descritos para la primera ronda de PCR, excepto la temperatura de hibridación que se reducirá a 43ºC. Diez microlitros de los productos de nPCR serán fraccionados por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8%, durante 3 horas a 100 voltios. La visualización de bandas se realizará mediante tinción con solución de nitrato de plata. Las muestras se clasificarán como positivas o negativas para el ADN del VPH según la inspección de las bandas teñidas con nitrato de plata. La amplificación por PCR se realizará por triplicado para cada muestra. Las muestras se clasificarán como positivas o negativas según el análisis de gel.

Las diferencias de proporción se evaluarán mediante la prueba exacta de Fisher. Un valor de P inferior a 0,05 se considerará estadísticamente significativo. Estos cálculos estadísticos se realizarán con SPSS, versión 10.0, para Windows.