Humant papillomavirus på oralt vev, spytt og serum (CDHPOTSS)

Denne studien ble utført ved bukkalkreftsenteret til UNESP og involverte førti pasienter (n = 40) og førti kontroller. Serumprøver, orale vattpinner og spytt vil samles på diagnostiseringsdatoen før behandling og lagres ved -80 ºC frem til analyse. Formalinfiksert parafininnstøpt oral plateepitelkarsinomvev og andre biologiske prøver vil behandle med fenol/kloroform-ekstraksjonsmetode.

Tumorer fra 40 OSCC-pasienter ved UNESP-universitetet vil bli innhentet fra biopsi med forhåndssamtykke, sammen med tilsvarende blodprøver fra venepunktur, spyttinnsamling og eksfolierte bukkalceller. Fra kontroller vil det bli innhentet alle prøver unntatt biopsivev. Klinisk informasjon inkludert tumorplassering, stadium og nodalstatus vil bli registrert.

Koagulerte blodprøver vil bli sentrifugert ved lav hastighet i 5 minutter, og serumet ble lagret ved -80 °C før DNA-ekstraksjon. Serumprøver (400 ml) vil bli brukt til DNA-ekstraksjon. Hele spytt og eksfolierte bukkalceller vil bli fordøyd i proteinase K ved 48 °C i løpet av to timer, serum- og tumorvevsprøver vil bli fordøyd i proteinase K ved 48 °C over natten, etterfulgt av fenol/kloroformekstraksjon og etanolutfelling av DNA for alle prøver. Etter resuspensjon i 50 ml destillert vann vil den gjennomsnittlige arbeids-DNA-konsentrasjonen være 100-150 ng/ml per serum- og vevsprøver og 30-50 ng/ml per hel spytt- og eksfolierte bukkalcelleprøver. For beta-globin PCR vil bli brukt 150 til 300 ng renset totalt cellulært DNA, for å vurdere kvaliteten på DNA ved å bruke PCR-primerne GH20 og PC04. Etter bekreftelse av tilstedeværelse og integritet av genomisk humant DNA, vil samme mengde DNA testes for HPV-DNA ved nestet polymerasekjedereaksjon (PCR) i alle prøver. I første PCR-runde vil degenererte konsensusprimere MY11 og MY09 brukes til å amplifisere fragmenter på 450 bp. HPV DNA vil ampliseres i en andre runde med GP5+ og GP6+ primersett. De andre reaksjonskomponentene vil være: 10,9 mikroliter ultrarent vann, 2,5 mikroliter PCR-buffer 10X, 4mM MgCl2, 15 pmol dNTP og 1 enhet Platinum Taq DNA-polymerase. Omtrent 150-300 ng genomisk DNA fra hver prøve vil bli tilsatt blandingen. Samme mengde Hela-celler, med opptil 4 kopier av HPV-18 per celle, vil bli brukt som positiv kontroll for HPV-infeksjon. Den negative kontrollen vil være sammensatt av alle PCR-komponenter unntatt DNA. Blandingen gjennomgikk initial denaturering til 94ºC i 10 minutter, før 40 PCR-sykluser (94ºC i 1 min; 55ºC i 1 min; 72ºC i 40) og 72ºC i 4 minutter. For nPCR vil to mikroliter av produktet fra den første reaksjonen brukes direkte i en reaksjon som inneholder: 0,02 mM av hver primer GP5+ og GP6+ (Invitrogen Life Technologies®, Brasil), som produserer et 150 pb DNA-fragment. De gjenværende reaksjonskomponentene og betingelsene vil være som beskrevet for den første runden med PCR, bortsett fra utglødningstemperaturen som vil reduseres til 43ºC. Ti mikroliter av nPCR-produktene vil bli fraksjonert ved elektroforese i en 8% polyakrylamidgel, i 3 timer ved 100 volt. Båndvisualisering vil bli utført ved farging med sølvnitratløsning. Prøver vil bli vurdert som enten HPV DNA-positive eller negative basert på inspeksjon av sølvnitratfargede bånd. PCR-amplifikasjon vil bli utført i triplikater for hver prøve. Prøver vil bli klassifisert som positive eller negative basert på gelanalyse.

Forskjeller i forhold vil bli evaluert ved hjelp av Fishers eksakte test. En P-verdi på mindre enn 0,05 vil bli ansett som statistisk signifikant. Disse statistiske beregningene vil bli utført med SPSS, versjon 10.0, for Windows.