Lidský papilomavirus na ústní tkáni, slinách a séru (CDHPOTSS)

Tato studie bude provedena v centru bukálního karcinomu UNESP a bude do ní zapojeno čtyřicet pacientů (n = 40) a čtyřicet kontrol. Vzorky séra, ústní tampony a sliny se odeberou v den diagnózy před terapií a budou uchovávány při -80 ºC až do analýzy. Tkáně orálního spinocelulárního karcinomu fixované v parafínu fixované ve formalínu a další biologické vzorky budou zpracovány extrakční metodou fenol/chloroform.

Nádory od 40 pacientů s OSCC na univerzitě UNESP budou získány z biopsie s předchozím souhlasem, spolu s odpovídajícími vzorky krve z venepunkce, odběrem slin a exfoliovaných bukálních buněk. Z kontrol budou odebrány všechny vzorky kromě bioptických tkání. Budou zaznamenány klinické informace včetně umístění nádoru, stadia a stavu uzlin.

Vzorky sražené krve budou centrifugovány při nízké rychlosti po dobu 5 minut a sérum bylo před extrakcí DNA skladováno při -80 °C. Pro extrakci DNA budou použity vzorky séra (400 ml). Celé sliny a exfoliované bukální buňky budou štěpeny proteinázou K při 48 °C během dvou hodin, vzorky séra a nádorové tkáně budou štěpeny proteinázou K při 48 °C přes noc, následuje extrakce fenolem/chloroformem a precipitace DNA pro všechny Vzorky. Po resuspendování v 50 ml destilované vody budou průměrné pracovní koncentrace DNA 100-150 ng/ml na vzorky séra a tkání a 30-50 ng/ml na vzorky celých slin a exfoliovaných bukálních buněk. Pro beta-globin PCR bude použito 150 až 300 ng purifikované celkové buněčné DNA, k posouzení kvality DNA pomocí PCR primerů GH20 a PC04. Po potvrzení přítomnosti a integrity genomové lidské DNA bude ve všech vzorcích testováno stejné množství DNA na HPV DNA pomocí nested polymerázové řetězové reakce (PCR). V prvním kole PCR budou k amplifikaci fragmentů o velikosti 450 bp použity degenerované konsenzuální primery MY11 a MY09. HPV DNA bude amplifikována ve druhém kole sadami primerů GP5+ a GP6+. Další reakční složky budou: 10,9 mikrolitrů ultračisté vody, 2,5 mikrolitrů PCR pufru 10X, 4mM MgCl2, 15 pmol dNTPs a 1 jednotka Platinum Taq DNA polymerázy. Ke směsi bude přidáno přibližně 150-300 ng genomové DNA z každého vzorku. Stejné množství buněk Hela, s až 4 kopiemi HPV-18 na buňku, bude použito jako pozitivní kontrola pro infekci HPV. Negativní kontrola bude složena ze všech složek PCR kromě DNA. Směs prošla počáteční denaturací na 94 °C po dobu 10 minut, před 40 cykly PCR (94 °C po dobu 1 minuty; 55 °C po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 40) a 72 °C po dobu 4 minut. Pro nPCR budou dva mikrolitry produktu z první reakce použity přímo v reakci obsahující: 0,02 mM každého primeru GP5+ a GP6+ (Invitrogen Life Technologies®, Brazílie), které produkují fragment DNA o velikosti 150 pb. Zbývající reakční složky a podmínky budou takové, jaké byly popsány pro první kolo PCR, kromě teploty nasedání, která bude snížena na 43ºC. Deset mikrolitrů produktů nPCR bude frakcionováno elektroforézou v 8% polyakrylamidovém gelu po dobu 3 hodin při 100 voltech. Vizualizace pásu bude provedena barvením roztokem dusičnanu stříbrného. Vzorky budou hodnoceny jako HPV DNA-pozitivní nebo negativní na základě kontroly pásů obarvených dusičnanem stříbrným. PCR amplifikace bude provedena v triplikátech pro každý vzorek. Vzorky budou na základě gelové analýzy klasifikovány jako pozitivní nebo negativní.

Rozdíly v proporcích budou vyhodnoceny pomocí Fisherova exaktního testu. Hodnota P menší než 0,05 bude považována za statisticky významnou. Tyto statistické výpočty budou provedeny pomocí SPSS, verze 10.0, pro Windows.