구강 조직, 타액 및 혈청에 대한 인간 유두종 바이러스 (CDHPOTSS)

이 연구는 UNESP의 구강암 센터에서 이루어지며 40명의 환자(n = 40)와 40명의 대조군이 참여합니다. 혈청 샘플, 구강 면봉 및 타액은 치료 전 진단 날짜에 수집되며 분석할 때까지 -80ºC에 보관됩니다. 포르말린 고정 파라핀 내장 구강 편평 세포 암종 조직 및 기타 생물학적 시료는 페놀/클로로포름 추출 방법으로 처리됩니다.

UNESP 대학의 40명의 OSCC 환자의 종양은 해당 정맥 천자 혈액, 타액 수집 및 박리된 구강 세포 샘플과 함께 사전 동의 하에 생검을 통해 얻을 것입니다. 컨트롤에서 생검 조직을 제외한 모든 샘플을 얻습니다. 종양 위치, 단계 및 결절 상태를 포함한 임상 정보가 기록됩니다.

응고된 혈액 표본을 5분 동안 저속으로 원심분리하고 혈청을 DNA 추출 전에 -80°C에서 보관했습니다. 혈청 샘플(400ml)은 DNA 추출에 사용됩니다. 전체 타액 및 박리된 구강 세포는 2시간 동안 48°C에서 단백분해효소 K로 소화되고, 혈청 및 종양 조직 샘플은 밤새 48°C에서 단백분해효소 K로 분해된 후 모든 사람에 대해 페놀/클로로포름 추출 및 DNA의 에탄올 침전이 수행됩니다. 견본. 50ml의 증류수에 재현탁한 후 평균 작업 DNA 농도는 혈청 및 조직 샘플당 100-150ng/ml이고 전체 타액 및 박리된 구강 세포 샘플당 30-50ng/ml입니다. 베타-글로빈 PCR의 경우 PCR 프라이머 GH20 및 PC04를 사용하여 DNA의 품질을 평가하기 위해 150~300ng의 정제된 총 세포 DNA를 사용합니다. 게놈 인간 DNA의 존재와 완전성을 확인한 후, 동일한 양의 DNA가 모든 샘플에서 중첩된 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 HPV DNA에 대해 테스트될 것입니다. 첫 번째 PCR 라운드에서 축퇴 컨센서스 프라이머 MY11 및 MY09는 450bp의 단편을 증폭하는 데 사용할 것입니다. HPV DNA는 GP5+ 및 GP6+ 프라이머 세트에 의해 두 번째 라운드에서 증폭됩니다. 다른 반응 구성 요소는 초순수 10.9마이크로리터, PCR 버퍼 10X 2.5마이크로리터, 4mM MgCl2, 15pmol dNTP 및 Platinum Taq DNA 중합효소 1유닛입니다. 각 샘플에서 약 150-300ng의 게놈 DNA가 혼합물에 추가됩니다. 세포당 최대 4개의 HPV-18 복제본이 있는 동일한 양의 Hela 세포가 HPV 감염에 대한 양성 대조군으로 사용됩니다. 음성 대조군은 DNA를 제외한 모든 PCR 구성 요소로 구성됩니다. 혼합물은 40 PCR 주기(94ºC에서 1분, 55ºC에서 1분, 72ºC에서 40분) 및 72°C에서 4분 전에 94ºC에서 10분간 초기 변성을 거쳤습니다. nPCR의 경우, 첫 번째 반응의 생성물 2마이크로리터는 다음을 포함하는 반응에 직접 사용됩니다. 나머지 반응 구성 요소 및 조건은 43ºC로 감소되는 어닐링 온도를 제외하고 PCR의 첫 번째 라운드에 대해 설명된 것과 같습니다. nPCR 산물 10마이크로리터를 8% 폴리아크릴아미드 겔에서 100볼트에서 3시간 동안 전기영동하여 분획합니다. 밴드 시각화는 질산은 용액으로 염색하여 수행됩니다. 샘플은 질산은으로 염색된 밴드 검사를 기반으로 HPV DNA 양성 또는 음성으로 점수가 매겨집니다. PCR 증폭은 각 샘플에 대해 3회 수행됩니다. 샘플은 겔 분석에 따라 양성 또는 음성으로 분류됩니다.

비율의 차이는 Fisher의 정확 테스트를 통해 평가됩니다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다. 이러한 통계 계산은 Windows용 SPSS 버전 10.0을 사용하여 수행됩니다.