Papillomavirus umano su tessuto orale, saliva e siero (CDHPOTSS)

Questo studio sarà effettuato presso il centro oncologico buccale dell'UNESP e ha coinvolto quaranta pazienti (n = 40) e quaranta controlli. Campioni di siero, tamponi orali e saliva verranno raccolti alla data della diagnosi prima della terapia e conservati a -80 ºC fino all'analisi. I tessuti di carcinoma a cellule squamose orali fissati in formalina e inclusi in paraffina e altri campioni biologici verranno processati con il metodo di estrazione con fenolo/cloroformio.

I tumori di 40 pazienti con OSCC presso l'Università UNESP saranno ottenuti dalla biopsia con previo consenso, insieme al sangue della venipuntura corrispondente, alla raccolta della saliva e ai campioni di cellule buccali esfoliate. Dai controlli saranno ottenuti tutti i campioni tranne i tessuti bioptici. Verranno registrate informazioni cliniche tra cui posizione del tumore, stadio e stato linfonodale.

I campioni di sangue coagulato saranno centrifugati a bassa velocità per 5 min, e il siero è stato conservato a -80 °C prima dell'estrazione del DNA. I campioni di siero (400 ml) verranno utilizzati per l'estrazione del DNA. La saliva intera e le cellule buccali esfoliate saranno digerite nella proteinasi K a 48°C per due ore, i campioni di siero e tessuto tumorale saranno digeriti nella proteinasi K a 48°C durante la notte, seguiti dall'estrazione con fenolo/cloroformio e dalla precipitazione con etanolo del DNA per tutti campioni. Dopo la risospensione in 50 ml di acqua distillata, le concentrazioni medie di lavoro del DNA saranno di 100-150 ng/ml per campioni di siero e tessuti e di 30-50 ng/ml per campioni di saliva intera e di cellule buccali esfoliate. Per la PCR beta-globina verranno utilizzati da 150 a 300 ng di DNA cellulare totale purificato, per valutare la qualità del DNA utilizzando i primer PCR GH20 e PC04. Dopo la conferma della presenza e dell'integrità del DNA umano genomico, la stessa quantità di DNA verrà testata per il DNA dell'HPV mediante reazione a catena della polimerasi annidata (PCR) in tutti i campioni. Nel primo ciclo di PCR verranno utilizzati i primer di consenso degenerati MY11 e MY09 per amplificare frammenti di 450 bp. Il DNA dell'HPV sarà amplificato in un secondo round dai set di primer GP5+ e GP6+. Gli altri componenti della reazione saranno: 10,9 microlitri di acqua ultrapura, 2,5 microlitri di tampone PCR 10X, 4 mM MgCl2, 15 pmol dNTP e 1 unità di Platinum Taq DNA polimerasi. Alla miscela verranno aggiunti circa 150-300 ng di DNA genomico da ciascun campione. La stessa quantità di cellule Hela, con un massimo di 4 copie di HPV-18 per cellula, verrà utilizzata come controllo positivo per l'infezione da HPV. Il controllo negativo sarà composto da tutti i componenti della PCR tranne il DNA. La miscela è stata sottoposta a denaturazione iniziale a 94°C per 10 min, prima di 40 cicli PCR (94°C per 1 min; 55°C per 1 min; 72°C per 40) e 72°C per 4 minuti. Per nPCR, due microlitri del prodotto della prima reazione saranno utilizzati direttamente in una reazione contenente: 0,02 mM di ciascun primer GP5+ e GP6+ (Invitrogen Life Technologies®, Brasile), che producono un frammento di DNA di 150 pb. I restanti componenti e condizioni di reazione saranno quelli descritti per il primo ciclo di PCR, ad eccezione della temperatura di ricottura che sarà ridotta a 43ºC. Dieci microlitri dei prodotti nPCR saranno frazionati mediante elettroforesi in un gel di poliacrilammide all'8%, per 3 ore a 100 volt. La visualizzazione delle bande sarà eseguita mediante colorazione con soluzione di nitrato d'argento. I campioni verranno valutati come HPV DNA positivi o negativi in ​​base all'ispezione delle bande colorate con nitrato d'argento. L'amplificazione PCR sarà eseguita in triplicato per ciascun campione. I campioni saranno classificati come positivi o negativi in ​​base all'analisi del gel.

Le differenze di proporzione saranno valutate mediante il test esatto di Fisher. Un valore P inferiore a 0,05 sarà considerato statisticamente significativo. Questi calcoli statistici verranno eseguiti utilizzando SPSS, versione 10.0, per Windows.