Humaan papillomavirus op oraal weefsel, speeksel en serum (CDHPOTSS)

Deze studie werd uitgevoerd in het buccale kankercentrum van UNESP en omvatte veertig patiënten (n = 40) en veertig controles. Serummonsters, orale uitstrijkjes en speeksel worden verzameld op de datum van diagnose vóór de therapie en worden bewaard bij -80 ºC tot analyse. In formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde orale plaveiselcelcarcinoomweefsels en andere biologische monsters worden verwerkt met de fenol/chloroform-extractiemethode.

Tumoren van 40 OSCC-patiënten aan de UNESP-universiteit zullen met voorafgaande toestemming worden verkregen uit biopsie, samen met bijbehorend venapunctiebloed, speekselverzameling en geëxfolieerde buccale cellenmonsters. Van de controles worden alle monsters verkregen, behalve biopsieweefsels. Klinische informatie, waaronder de locatie van de tumor, het stadium en de nodale status, wordt geregistreerd.

Geklonterde bloedmonsters worden gedurende 5 minuten bij lage snelheid gecentrifugeerd en het serum wordt vóór DNA-extractie bij -80 °C bewaard. Serummonsters (400 ml) zullen worden gebruikt voor DNA-extractie. Hele speeksel en geëxfolieerde buccale cellen worden gedigereerd in proteïnase K bij 48 °C gedurende twee uur, serum- en tumorweefselmonsters worden verteerd in proteïnase K bij 48 °C gedurende de nacht, gevolgd door fenol/chloroform-extractie en ethanolprecipitatie van DNA voor alle monsters. Na opnieuw suspenderen in 50 ml gedestilleerd water zullen de gemiddelde werkende DNA-concentraties 100-150 ng/ml per serum- en weefselmonster zijn en 30-50 ng/ml per volledig speeksel en geëxfolieerde buccale cellenmonsters. Voor beta-globine PCR zal 150 tot 300 ng gezuiverd totaal cellulair DNA worden gebruikt om de kwaliteit van het DNA te beoordelen met behulp van de PCR-primers GH20 en PC04. Na bevestiging van de aanwezigheid en integriteit van genomisch menselijk DNA, zal dezelfde hoeveelheid DNA in alle monsters worden getest op HPV-DNA door geneste polymerasekettingreactie (PCR). In de eerste PCR-ronde zullen gedegenereerde consensusprimers MY11 en MY09 worden gebruikt om fragmenten van 450 bp te amplificeren. HPV-DNA wordt in een tweede ronde geamplificeerd door GP5+- en GP6+-primersets. De andere reactiecomponenten zijn: 10,9 microliter ultrazuiver water, 2,5 microliter PCR-buffer 10X, 4 mM MgCl2, 15 pmol dNTP's en 1 eenheid Platinum Taq DNA-polymerase. Ongeveer 150-300 ng genomisch DNA van elk monster wordt aan het mengsel toegevoegd. Dezelfde hoeveelheid Hela-cellen, met maximaal 4 kopieën van HPV-18 per cel, wordt gebruikt als positieve controle voor HPV-infectie. De negatieve controle zal worden samengesteld uit alle PCR-componenten behalve DNA. Het mengsel onderging initiële denaturatie tot 94°C gedurende 10 min, vóór 40 PCR-cycli (94°C gedurende 1 min; 55°C gedurende 1 min; 72°C gedurende 40) en 72°C gedurende 4 minuten. Voor nPCR wordt twee microliter van het product van de eerste reactie direct gebruikt in een reactie die bevat: 0,02 mM van elke primer GP5+ en GP6+ (Invitrogen Life Technologies®, Brazilië), die een DNA-fragment van 150 pb produceren. De resterende reactiecomponenten en omstandigheden zullen zijn zoals beschreven voor de eerste PCR-ronde, behalve de annealingstemperatuur die zal worden verlaagd tot 43°C. Tien microliter van de nPCR-producten zal worden gefractioneerd door middel van elektroforese in een 8% polyacrylamidegel, gedurende 3 uur bij 100 volt. Bandvisualisatie zal worden uitgevoerd door te kleuren met zilvernitraatoplossing. Monsters worden beoordeeld als HPV-DNA-positief of -negatief op basis van de inspectie van met zilvernitraat gekleurde banden. PCR-amplificatie zal voor elk monster in drievoud worden uitgevoerd. Monsters worden geclassificeerd als positief of negatief op basis van gelanalyse.

Verschillen in proportie zullen worden geëvalueerd door middel van Fisher's exact test. Een P-waarde van minder dan 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd. Deze statistische berekeningen worden uitgevoerd met SPSS, versie 10.0, voor Windows.