Humanes Papillomavirus auf Mundgewebe, Speichel und Serum (CDHPOTSS)

Diese Studie wird am Mundkrebszentrum von UNESP durchgeführt und umfasst vierzig Patienten (n = 40) und vierzig Kontrollpersonen. Serumproben, Mundabstriche und Speichel werden zum Zeitpunkt der Diagnose vor der Therapie entnommen und bis zur Analyse bei -80 °C gelagert. Formalinfixierte, in Paraffin eingebettete, orale Plattenepithelkarzinomgewebe und andere biologische Proben werden mit der Phenol/Chloroform-Extraktionsmethode verarbeitet.

Tumore von 40 OSCC-Patienten an der UNESP-Universität werden nach vorheriger Zustimmung aus einer Biopsie entnommen, zusammen mit entsprechendem Venenpunktionsblut, Speichelproben und exfoliierten Wangenzellenproben. Von den Kontrollen werden alle Proben mit Ausnahme von Biopsiegeweben erhalten. Klinische Informationen, einschließlich Tumorlokalisation, Stadium und Lymphknotenstatus, werden aufgezeichnet.

Geronnene Blutproben werden 5 min lang bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, und das Serum wurde vor der DNA-Extraktion bei -80 °C gelagert. Serumproben (400 ml) werden für die DNA-Extraktion verwendet. Vollständiger Speichel und abgeblätterte Wangenzellen werden zwei Stunden lang bei 48 °C in Proteinase K verdaut, Serum- und Tumorgewebeproben werden über Nacht bei 48 °C in Proteinase K verdaut, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung der DNA für alle Proben. Nach der Resuspendierung in 50 ml destilliertem Wasser betragen die mittleren Arbeits-DNA-Konzentrationen 100-150 ng/ml pro Serum- und Gewebeprobe und 30-50 ng/ml pro Gesamtspeichel und abgeblätterten Wangenzellenproben. Für die Beta-Globin-PCR werden 150 bis 300 ng gereinigte zelluläre Gesamt-DNA verwendet, um die Qualität der DNA unter Verwendung der PCR-Primer GH20 und PC04 zu beurteilen. Nach Bestätigung des Vorhandenseins und der Unversehrtheit genomischer menschlicher DNA wird in allen Proben die gleiche DNA-Menge auf HPV-DNA durch verschachtelte Polymerase-Kettenreaktion (PCR) getestet. In der ersten PCR-Runde werden die degenerierten Consensus-Primer MY11 und MY09 verwendet, um Fragmente von 450 bp zu amplifizieren. HPV-DNA wird in einer zweiten Runde durch GP5+- und GP6+-Primersets amplifiziert. Die anderen Reaktionskomponenten sind: 10,9 Mikroliter ultrareines Wasser, 2,5 Mikroliter PCR-Puffer 10X, 4 mM MgCl2, 15 pmol dNTPs und 1 Einheit Platinum Taq DNA-Polymerase. Etwa 150-300 ng genomische DNA aus jeder Probe werden der Mischung zugesetzt. Die gleiche Menge an Hela-Zellen mit bis zu 4 Kopien von HPV-18 pro Zelle wird als Positivkontrolle für die HPV-Infektion verwendet. Die Negativkontrolle besteht aus allen PCR-Komponenten außer DNA. Die Mischung wurde einer anfänglichen Denaturierung bei 94 °C für 10 Minuten unterzogen, bevor 40 PCR-Zyklen (94 °C für 1 Minute; 55 °C für 1 Minute; 72 °C für 40) und 72 °C für 4 Minuten durchgeführt wurden. Für nPCR werden zwei Mikroliter des Produkts aus der ersten Reaktion direkt in einer Reaktion verwendet, die Folgendes enthält: 0,02 mM von jedem Primer GP5+ und GP6+ (Invitrogen Life Technologies®, Brasilien), die ein 150 pb DNA-Fragment produzieren. Die restlichen Reaktionskomponenten und -bedingungen sind wie für die erste PCR-Runde beschrieben, mit Ausnahme der Annealing-Temperatur, die auf 43 °C reduziert wird. Zehn Mikroliter der nPCR-Produkte werden durch Elektrophorese in einem 8%igen Polyacrylamidgel für 3 Stunden bei 100 Volt fraktioniert. Die Bandenvisualisierung erfolgt durch Anfärben mit Silbernitratlösung. Die Proben werden basierend auf der Untersuchung der mit Silbernitrat gefärbten Banden entweder als HPV-DNA-positiv oder -negativ bewertet. Die PCR-Amplifikation wird für jede Probe dreifach durchgeführt. Die Proben werden basierend auf der Gelanalyse als positiv oder negativ klassifiziert.

Unterschiede in den Proportionen werden mit dem exakten Test nach Fisher bewertet. Ein P-Wert von weniger als 0,05 wird als statistisch signifikant betrachtet. Diese statistischen Berechnungen werden mit SPSS, Version 10.0, für Windows durchgeführt.