Isolement et caractérisation des cellules souches cancéreuses à l'aide de la technique iFP

Il y a eu un intérêt croissant ces dernières années pour les cellules souches cancéreuses (CSC) et leur implication dans la biologie et la thérapie du cancer.

Les CSC font référence à un sous-ensemble de cellules tumorales qui ont la capacité de s'auto-renouveler et de générer les diverses cellules qui composent la tumeur.

Ces cellules ont été appelées cellules souches cancéreuses pour refléter leurs propriétés « semblables à des tiges » et leur capacité à initier et à maintenir continuellement la tumorigenèse.

Les CSC partagent des propriétés importantes avec les cellules souches des tissus normaux, y compris l'auto-renouvellement (par division symétrique et asymétrique) et la capacité de différenciation, quoique aberrante. La différenciation multilignée, cependant, n'est pas une caractéristique obligatoire d'un CSC. De plus, on pense que ces cellules sont résistantes au traitement conventionnel du cancer, y compris la chimiothérapie et la radiothérapie, ce qui peut expliquer le repeuplement rapide des cellules tumorales après un traitement principalement par ce sous-type de cellules. Par conséquent, de nouvelles méthodes thérapeutiques pour cibler les CSC font actuellement l'objet d'études approfondies.

L'une des principales difficultés pour trouver et identifier les SCC est qu'ils sont difficiles à isoler, à développer et à enrichir.

Plusieurs tests in vitro ont été utilisés pour identifier les cellules souches, y compris les tests de sphère, les tests d'unités formant colonies (CFU) en série (tests de replaquage) et les tests de rétention d'étiquettes.

Des études ont également été réalisées dans le but de déterminer les signatures génétiques qui définissent les CSC. Cependant, chacune de ces méthodes présente des pièges potentiels qui compliquent l'interprétation des résultats.

Par conséquent, une méthode supplémentaire pour récolter et enrichir facilement les CSC est nécessaire. Actuellement, la grande majorité des cellules sont cultivées dans des plaques et des flacons plats en plastique dur 2D inertes vis-à-vis des cellules. Cependant, les CSC sont cultivées dans des conditions sans sérum 3-D, ce qui rend leur croissance lente et compliquée.

Souvent, des protéines, telles que la fibronectine ou le collagène, ont été utilisées comme revêtements pour rendre le plastique plus "compatible avec les cellules". Cependant les rendements sont encore faibles ; les coûts sont élevés et nécessitent beaucoup d'espace au sol (grande empreinte). De plus, les cellules attachées au plastique doivent être trypsinisées afin de transférer ou de s'implanter affectant la survie des cellules exposées aux enzymes digérantes.

Le fibrinogène est une protéine de phase aiguë, présente à 2-4g/l dans le sang humain, lors d'un traitement avec des glucocorticoïdes, une inflammation ou un traumatisme, la concentration de fibrinogène augmente Le fibrinogène exerce un effet adhésif sur les fibroblastes cultivés et d'autres cellules. Plus précisément, le fibrinogène et ses divers fragments lytiques (D.E, FPA) se sont avérés chimiotactiques vis-à-vis des macrophages, des fibroblastes humains et des cellules endothéliales.

La matrice de fibrine est couramment utilisée pour l'hémostase chirurgicale et le scellement des tissus. Le fibrinogène natif est soluble dans un tampon aqueux et ne peut généralement pas être utilisé pour des applications de culture cellulaire, sauf comme revêtement pour les plastiques. Cependant, lorsqu'il est mélangé à une trace de thrombine, il se transforme en un caillot de fibrine insoluble qui attire les cellules et fournit une matrice provisoire pour la réparation des tissus.

Plan expérimental :

1. Génération et enrichissement de CSC (in vitro) à partir de lignées cellulaires établies de cancer humain en utilisant les techniques standard décrites dans Méthodes . Ces cellules seront cultivées et développées sous forme de monocouches dans un milieu contenant du sérum ou sous forme de sphères dans un milieu sans sérum complété par des facteurs de croissance. (18-7-19) Nous évaluerons la capacité des cellules à former des sphères et caractériserons leurs propriétés de cellules souches en utilisant la détection de marqueurs de surface et la mesure de l'activité ALDH.

2. Croissance des CSC sur la substance iFP :

   L'iFP peut présenter une réponse d'attachement élevée pour les cellules cancéreuses, conserver le marqueur de surface cellulaire et donner un taux de croissance optimal. De plus, les cellules sur IFP pourraient être transférées sans trypsinisation, ce qui peut diminuer les dommages cellulaires lors de la récolte à partir d'une plaque en plastique, ce qui entraîne une survie plus élevée.

   Les cellules seront cultivées dans des plats recouverts de substance iFP comme décrit dans les méthodes. Après 2 semaines de culture, les cellules seront récoltées identifiées pour les CSC pour les propriétés des cellules souches cancéreuses en utilisant les mêmes méthodes que nous avons décrites ci-dessus (par exemple, les marqueurs de surface et l'activité ALDH).

3. Isoler et enrichir les CSC à partir d'échantillons de tumeurs fraîches Cet objectif vise à promouvoir l'implication de l'iFP dans la recherche sur le cancer en étudiant, en récoltant et en cultivant des CSC obtenues à partir de tumeurs fraîches et en les utilisant ensuite pour des tests thérapeutiques in vitro. Une telle approche peut optimiser la thérapie qui peut cibler ce type de cellule.

Des échantillons de tumeurs seront obtenus de patients consentants conformément à l'examen interne et au comité d'éthique.

Des échantillons tumoraux seront prélevés au service de pathologie à partir du bilan diagnostique histologique lors de la résection tumorale (lorsque les échantillons sont encore frais). Ainsi, les échantillons seront reçus au laboratoire dans les 30 minutes suivant la chirurgie.

Les tumeurs seront préparées sous forme de suspensions de cellules individuelles, puis seront cultivées en utilisant soit la méthode standard conventionnelle, soit l'iFP. Par la suite, les cellules seront récoltées et évaluées pour les caractéristiques du SCC en utilisant la même méthode que nous avons utilisée pour les lignées cellulaires. Une comparaison du rendement du pourcentage de CSC sera effectuée entre l'iFP et la méthodologie conventionnelle.