Aislamiento y caracterización de células madre cancerosas mediante la técnica iFP

Ha habido un interés creciente en los últimos años en las células madre del cáncer (CSC) y su implicación en la biología y la terapia del cáncer.

Las CSC se refieren a un subconjunto de células tumorales que tienen la capacidad de autorrenovarse y generar las diversas células que componen el tumor.

Estas células se han denominado células madre cancerosas para reflejar sus propiedades 'similares a un tallo' y su capacidad para iniciar y mantener continuamente la tumorigénesis.

Las CSC comparten propiedades importantes con las células madre tisulares normales, incluida la autorrenovación (por división simétrica y asimétrica) y la capacidad de diferenciación, aunque aberrante. La diferenciación multilinaje, sin embargo, no es una característica obligatoria de un CSC. Además, se cree que estas células son resistentes a la terapia convencional contra el cáncer, incluidas la quimioterapia y la radioterapia, lo que puede explicar la rápida repoblación de células tumorales después del tratamiento principalmente con este subtipo de células, por lo que ahora se están investigando a fondo nuevos métodos terapéuticos para atacar las CSC.

Una de las principales dificultades para encontrar e identificar CSC es que son difíciles de aislar, hacer crecer y enriquecer.

Se han utilizado varios ensayos in vitro para identificar células madre, incluidos ensayos de esfera, ensayos de unidades formadoras de colonias (UFC) en serie (ensayos de reposición) y ensayos de retención de etiquetas.

También se han realizado estudios con el objetivo de determinar las firmas genéticas que definen las CSC. Sin embargo, cada uno de estos métodos tiene peligros potenciales que complican la interpretación de los resultados.

Por lo tanto, se requiere un método adicional para recolectar y enriquecer fácilmente las CSC. En la actualidad, la gran mayoría de las células se cultivan en placas y matraces planos de plástico duro en 2D que son inertes para las células. Sin embargo, las CSC se cultivan en condiciones sin suero tridimensionales, lo que hace que su crecimiento sea lento y complicado.

A menudo, las proteínas, como la fibronectina o el colágeno, se han empleado como recubrimientos para hacer que el plástico sea más "amigable con las células". Sin embargo, los rendimientos siguen siendo bajos; los costos son altos y requieren mucho espacio en el piso (tamaño grande). Además, las células adheridas al plástico deben ser tripsinizadas para poder transferirlas o implantarlas, lo que afecta la supervivencia de las células expuestas a las enzimas de digestión.

El fibrinógeno es una proteína de fase aguda, que se encuentra en 2-4 g/l en la sangre humana, tras el tratamiento con glucocorticoides, inflamación o trauma, la concentración de fibrinógeno aumenta. El fibrinógeno ejerce un efecto adhesivo sobre los fibroblastos cultivados y otras células. Específicamente, se demostró que el fibrinógeno y sus diversos fragmentos líticos (D.E, FPA) son quimiotácticos para macrófagos, fibroblastos humanos y células endoteliales.

La matriz de fibrina se usa comúnmente para la hemostasia quirúrgica y el sellado de tejidos. La fibrina (ógeno), un posible candidato a partir del cual se podría fabricar una matriz tridimensional para el cultivo celular, es el componente principal del sistema de coagulación de la sangre. El fibrinógeno nativo es soluble en tampón acuoso y normalmente no se puede emplear para aplicaciones de cultivo celular, excepto como recubrimiento para plásticos. Sin embargo, cuando se mezcla con trazas de trombina, se transforma en un coágulo de fibrina insoluble que atrae células y proporciona una matriz provisional para la reparación de tejidos.

Plano experimental:

1. Generación y enriquecimiento de CSC (in vitro) a partir de líneas celulares establecidas de cáncer humano. Aislaremos, purificaremos y caracterizaremos CSC de una serie de líneas celulares establecidas que incluyen glioma humano U87-MG, carcinoma de mama MCF7 y adenocarcinoma pancreático humano PANC-1. usando técnicas estándar como se describe en Métodos. Estas células se cultivarán y crecerán como monocapas en medio que contiene suero o como esferas en medio sin suero complementado con factores de crecimiento. (18-7-19) Evaluaremos la capacidad de las células para formar esferas y caracterizaremos sus propiedades de células madre mediante la detección de marcadores de superficie y la medición de la actividad de ALDH.

2. Cultivo de CSC en sustancia iFP:

   iFP puede exhibir una alta respuesta de unión para las células cancerosas, conservar el marcador de superficie celular y producir una tasa de crecimiento óptima. Además, las células en IFP podrían transferirse sin tripsinización, lo que puede disminuir el daño celular durante la recolección de la placa de plástico, lo que resulta en una mayor supervivencia.

   Las células se cultivarán en placas recubiertas con sustancia iFP como se describe en Métodos. Después de 2 semanas en cultivo, las células se recolectarán identificadas para CSC para propiedades de células madre cancerosas utilizando los mismos métodos que describimos anteriormente (por ejemplo, marcadores de superficie y actividad ALDH).

3. Aislar y enriquecer CSC de muestras de tumores frescos Este objetivo se diseñó para promover la implicación de iFP en la investigación del cáncer mediante el estudio, la recolección y el cultivo de CSC obtenidas de tumores frescos y su posterior uso para pruebas terapéuticas in vitro. Tal enfoque puede optimizar la terapia que puede dirigirse a este tipo de células.

Las muestras de tumores se obtendrán de los pacientes que den su consentimiento de acuerdo con la Revisión interna y la Junta de ética.

Las muestras del tumor se recolectarán del departamento de patología de la evaluación de diagnóstico histológico durante la resección del tumor (cuando las muestras aún están frescas). Así, las muestras serán recibidas en el Laboratorio dentro de los 30 minutos posteriores a la cirugía.

Los tumores se prepararán como suspensiones de células individuales y luego se cultivarán utilizando el método estándar convencional o iFP. Posteriormente, las células se cosecharán y evaluarán para las características de CSC utilizando el mismo método que usamos para las líneas celulares. Se realizará una comparación del rendimiento del porcentaje de CSC entre iFP y la metodología convencional.