Izolace a charakterizace rakovinných kmenových buněk pomocí techniky iFP

V posledních letech vzrůstá zájem o rakovinné kmenové buňky (CSC) a jejich implikaci v biologii a terapii rakoviny.

CSC označují podskupinu nádorových buněk, které mají schopnost sebeobnovy a generování různých buněk, které tvoří nádor.

Tyto buňky byly nazvány rakovinné kmenové buňky, aby odrážely jejich „kmenové“ vlastnosti a schopnost nepřetržitě iniciovat a udržovat tumorigenezi.

CSC sdílejí důležité vlastnosti s normálními tkáňovými kmenovými buňkami, včetně samoobnovy (symetrickým a asymetrickým dělením) a diferenciační kapacity, i když aberantní. Víceliniová diferenciace však není povinným prvkem CSC. Kromě toho se předpokládá, že tyto buňky jsou odolné vůči konvenční terapii rakoviny včetně chemoterapie a radioterapie, což může vysvětlit rychlou repopulaci nádorových buněk po léčbě hlavně tímto podtypem buněk, proto je nyní důkladně zkoumána nová terapeutická metoda pro cílení CSC.

Jedním z hlavních problémů při hledání a identifikaci CSC je to, že je těžké je izolovat, pěstovat a obohacovat.

K identifikaci kmenových buněk bylo použito několik in vitro testů, včetně kulových testů, sériových testů jednotek tvořících kolonie (CFU) (testy opětovného nanesení) a testů retence značky.

Byly také provedeny studie s cílem určit genetické podpisy, které definují CSC. Každá z těchto metod má však potenciální úskalí, která komplikují interpretaci výsledků.

Proto je zapotřebí další metoda pro snadné sklízení a obohacení CSC. V současné době je velká většina buněk kultivována v 2-D plochých tvrdých plastových deskách a baňkách, které jsou vůči buňkám inertní. CSC se však pěstují v podmínkách 3-D bez séra, což zpomaluje a komplikuje jejich růst.

Často se jako povlaky používají proteiny, jako je fibronektin nebo kolagen, aby se plast stal "přátelštějším k buňkám". Výtěžky jsou však stále nízké; náklady jsou vysoké a vyžadují hodně podlahové plochy (velký půdorys). Kromě toho musí být buňky připojené k plastu trypsinizovány, aby mohly být přeneseny nebo implantovány, což ovlivňuje přežití buněk vystavených trávicím enzymům.

Fibrinogen je protein akutní fáze, vyskytující se v koncentraci 2-4 g/l v lidské krvi, po léčbě glukokortikoidem, zánětu nebo traumatu, zvýšení koncentrace fibrinogenu Fibrinogen má adhezivní účinek na kultivované fibroblasty a další buňky. Konkrétně se ukázalo, že fibrinogen a jeho různé lytické fragmenty (D.E,FPA) jsou chemotaktické vůči makrofágům, lidským fibroblastům a endoteliálním buňkám.

Fibrinová matrice je běžně používaná chirurgická hemostáza a utěsnění tkáně Fibrin(ogen) - možný kandidát, ze kterého by mohla být vyrobena 3-D matrice pro buněčnou kultivaci, je hlavní složkou systému koagulace krve. Nativní fibrinogen je rozpustný ve vodném pufru a nemůže být obvykle použit pro aplikace buněčných kultur, s výjimkou jako povlak na plasty. Po smíchání se stopou trombinu se však přemění na nerozpustnou fibrinovou sraženinu, která přitahuje buňky a poskytuje provizorní matrici pro opravu tkáně.

Experimentální plán:

1. Vytváření a obohacování CSC (in vitro) ze zavedených buněčných linií lidské rakoviny Budeme izolovat, purifikovat a charakterizovat CSC ze série zavedených buněčných linií včetně lidského gliomu U87-MG, karcinomu prsu MCF7 a lidského adenokarcinomu pankreatu PANC-1, za použití standardních technik popsaných v části Metody. Tyto buňky budou kultivovány a pěstovány jako monovrstvy v médiu obsahujícím sérum nebo jako kuličky v médiu bez séra doplněném růstovými faktory (18-7-19). Budeme hodnotit schopnost buněk tvořit koule a charakterizovat vlastnosti jejich kmenových buněk pomocí detekce povrchových markerů a měření aktivity ALDH.

2. Pěstování CSC na látce iFP:

   iFP může vykazovat vysokou vazebnou odezvu pro rakovinné buňky, šetřit marker buněčného povrchu a poskytovat optimální rychlost růstu. Kromě toho by buňky na IFP mohly být přeneseny bez trypsinizace, což může snížit poškození buněk během sklizně z plastové desky, což vede k vyššímu přežití.

   Buňky budou kultivovány v miskách potažených látkou iFP, jak je popsáno v metodách. Po 2 týdnech v kultuře budou sklizeny buňky identifikované pro CSC pro vlastnosti rakovinných kmenových buněk za použití stejných metod, které jsme popsali výše (např. povrchové markery a ALDH aktivita).

3. Izolovat a obohatit CSC z čerstvých nádorových vzorků Tento cíl je navržen tak, aby podpořil implikaci iFP ve výzkumu rakoviny studiem, sběrem a pěstováním CSC získaných z čerstvých nádorů a jejich následným použitím pro terapeutické testování in vitro. Takový přístup může optimalizovat terapii, která se může zaměřit na tento typ buněk.

Vzorky nádorů budou získány od souhlasných pacientů podle Interní revize a Etické rady.

Vzorky nádoru budou odebrány z patologického oddělení z histologického diagnostického posouzení při resekci nádoru (když jsou vzorky ještě čerstvé). Vzorky tak budou přijaty do laboratoře do 30 minut po operaci.

Nádory budou připraveny jako jednobuněčné suspenze a poté budou pěstovány buď konvenční standardní metodou nebo iFP. Následně budou buňky sklizeny a vyhodnoceny na CSC charakteristiky pomocí stejné metody, kterou jsme použili pro buněčné linie. Porovnání procenta výnosu CSC bude provedeno mezi iFP a konvenční metodikou.