Isolamento e caracterização de células-tronco cancerígenas usando a técnica iFP

Nos últimos anos, tem havido um interesse crescente em células-tronco cancerígenas (CSC) e sua implicação na biologia e terapia do câncer.

As CSCs referem-se a um subconjunto de células tumorais que tem a capacidade de se auto-renovar e gerar as diversas células que compõem o tumor.

Essas células foram denominadas células-tronco cancerígenas para refletir suas propriedades "semelhantes a tronco" e capacidade de iniciar e sustentar continuamente a tumorigênese.

As CSC compartilham propriedades importantes com as células-tronco de tecidos normais, incluindo a autorrenovação (por divisão simétrica e assimétrica) e a capacidade de diferenciação, embora aberrante. A diferenciação multilinhagem, no entanto, não é uma característica obrigatória de um CSC. Além disso, acredita-se que essas células sejam resistentes à terapia convencional contra o câncer, incluindo quimioterapia e radioterapia, o que pode explicar a rápida repopulação das células tumorais após o tratamento principalmente por esse subtipo de células; portanto, novos métodos terapêuticos para atingir as CSCs estão agora sob investigação minuciosa.

Uma das maiores dificuldades em encontrar e identificar CSC é que eles são difíceis de isolar, crescer e enriquecer.

Vários ensaios in vitro têm sido usados ​​para identificar células-tronco, incluindo ensaios de esferas, ensaios de unidades formadoras de colônias (CFU) seriais (ensaios de replating) e ensaios de retenção de rótulos.

Estudos também têm sido realizados com o objetivo de determinar as assinaturas genéticas que definem as CSCs. No entanto, cada um desses métodos tem armadilhas potenciais que complicam a interpretação dos resultados.

Portanto, é necessário um método adicional para colher e enriquecer facilmente os CSCs. Atualmente, a grande maioria das células é cultivada em placas planas de plástico rígido 2-D e frascos que são inertes para as células. No entanto, as CSCs são cultivadas em condições isentas de soro 3-D, o que torna seu crescimento lento e complicado.

Freqüentemente, proteínas, como fibronectina ou colágeno, têm sido empregadas como revestimentos para tornar o plástico mais "amigável às células". No entanto, os rendimentos ainda são baixos; os custos são altos e requerem muito espaço físico (pegada grande). Além disso, as células aderidas ao plástico devem ser tripsinizadas para serem transferidas ou implantadas, afetando a sobrevivência das células expostas às enzimas digestivas.

O fibrinogênio é uma proteína de fase aguda, ocorrendo em 2-4g/l no sangue humano, após tratamento com glicocorticóides, inflamação ou trauma, a concentração de fibrinogênio aumenta. O fibrinogênio exerce efeito adesivo em fibroblastos cultivados e outras células. Especificamente, o fibrinogênio e seus vários fragmentos líticos (D.E, FPA) demonstraram ser quimiotáticos para macrófagos, fibroblastos humanos e células endoteliais.

A matriz de fibrina é comumente usada para hemostasia cirúrgica e selagem de tecidos. Fibrina(gênio) - um possível candidato a partir do qual uma matriz 3-D para cultura de células pode ser fabricada, é o principal componente do sistema de coagulação do sangue. O fibrinogênio nativo é solúvel em tampão aquoso e geralmente não pode ser empregado para aplicações de cultura de células, exceto como revestimento para plásticos. No entanto, quando misturado com um traço de trombina, transforma-se em um coágulo de fibrina insolúvel que atrai células e fornece uma matriz provisória para reparo tecidual.

Plano Experimental:

1. Geração e enriquecimento de CSC (in vitro) a partir de linhas celulares estabelecidas de câncer humano Iremos isolar, purificar e caracterizar CSC de uma série de linhagens celulares estabelecidas, incluindo glioma humano U87-MG, carcinoma de mama MCF7 e adenocarcinoma pancreático humano PANC-1, usando técnicas padrão conforme descrito em Métodos. Estas células serão cultivadas e cultivadas como monocamadas em meio contendo soro ou como esferas em meio isento de soro suplementado por fatores de crescimento.(18-7-19) Avaliaremos a capacidade das células de formar esferas e caracterizaremos suas propriedades de células-tronco usando a detecção de marcadores de superfície e medindo a atividade de ALDH.

2. Crescendo CSCs na substância iFP:

   O iFP pode exibir uma alta resposta de adesão para células cancerígenas, conservar o marcador de superfície celular e produzir uma taxa de crescimento ideal. Além disso, as células no IFP podem ser transferidas sem tripsinização, o que pode diminuir o dano celular durante a colheita da placa de plástico, resultando em maior sobrevivência.

   As células serão cultivadas em pratos revestidos com substância iFP, conforme descrito nos Métodos. Após 2 semanas em cultura, as células serão colhidas identificadas para CSCs para propriedades de células-tronco cancerígenas usando os mesmos métodos que descrevemos acima (por exemplo, marcadores de superfície e atividade ALDH).

3. Isolar e enriquecer CSCs de amostras de tumores recentes Este objetivo foi concebido para promover a implicação do iFP na pesquisa do câncer, estudando, colhendo e cultivando CSCs obtidos de tumores frescos e subsequentemente usando-os para testes terapêuticos in vitro. Tal abordagem pode otimizar a terapia que pode ter como alvo esse tipo de célula.

As amostras de tumor serão obtidas de pacientes que consentiram de acordo com a Revisão Interna e o Conselho de Ética.

Amostras tumorais serão coletadas do departamento de patologia a partir da avaliação diagnóstica histológica durante a ressecção do tumor (quando as amostras ainda estão frescas). Assim, as amostras serão recebidas no Laboratório em até 30 minutos após a cirurgia.

Os tumores serão preparados como suspensões de células únicas e, em seguida, serão cultivados usando o método padrão convencional ou iFP. Posteriormente, as células serão colhidas e avaliadas quanto às características de CSC usando o mesmo método que usamos para as linhagens celulares. Uma comparação do rendimento percentual de CSC será realizada entre o iFP e a metodologia convencional.