Les SNP du gène DNase 1 altèrent son activité et sont augmentés dans une cohorte de patients STE-ACS par rapport aux témoins sains

Contexte Le syndrome coronarien aigu (SCA) est l'une des principales causes de décès(1). L'athérosclérose et l'occlusion thrombotique coronarienne sont induites par des mécanismes pathogéniques inflammatoires(2). Les chercheurs ont mis en évidence une activation des neutrophiles et des pièges extracellulaires de neutrophiles (NET) au site de lésion coupable des patients atteints de SCA avec élévation du segment ST (STE-ACS) (3). Les TNE sont des composants bien décrits des thrombus, construisant un noyau de condensation pour les plaquettes, les érythrocytes et le fibrinogène. Les thrombi contenant NET peuvent être efficacement lysés par la désoxyribonucléase (DNase) in vitro(4). En ajoutant de la DNase, les chercheurs ont montré une puissante accélération de la lyse médiée par l'activateur tissulaire du plasminogène des thrombi coronaires ex vivo. Les marqueurs de substitution des TNE sont de puissants prédicteurs d'événements coronariens aigus(5). Chez les patients STE-ACS, les TNE étaient directement corrélées à la taille de l'infarctus mesurée par résonance magnétique magnétique. De plus, l'activité accrue de la DNase coronarienne était corrélée à une taille d'infarctus plus petite (3).

Deux DNases plasmatiques endogènes majeures ont été décrites, à savoir la DNase 1 et la DNase gamma(6). Plusieurs polymorphismes du gène codant pour la DNase 1 affectant son activité sont connus(7,8). Le polymorphisme mononucléotidique (SNP) Q222R dans le gène de la DNase 1, entraînant une altération de l'activité de la DNase extracellulaire, était corrélé à une incidence accrue d'infarctus du myocarde chez les patients japonais(9). Les SNP associés à une activité DNase réduite sont également connus pour la DNase gamma, mais aucune association avec l'ACS n'a été étudiée. Les données actuelles impliquent un équilibre critique entre la formation et la dégradation des TNE et les résultats de l'ACS.

Justification Les enquêteurs émettent l'hypothèse que la formation de TNE endoluminales coronaires est une composante majeure de l'athérothrombose aiguë des macro- et micro-vaisseaux. La DNase extracellulaire dégrade les NET, régulant ainsi à la baisse la formation écrasante de NET. L'activité déficiente de la DNase augmente le risque de SCA. Ainsi, les chercheurs cherchent à tester la présence de polymorphismes dans le gène de la DNase altérant l'activité de la DNase dans une population STE-ACS.

Objectifs

1. Comparer les polymorphismes d'un seul nucléotide dans les gènes DNase 1 et gamma chez les patients STE-ACS, les patients coronariens et les témoins sains à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase
2. Pour tester l'activité de la DNase dans le plasma de ces patients et de témoins sains et pour la corréler avec le type d'expression génique respectif
3. Pour tester la formation de NET et les marqueurs de substitution NET et pour corréler ceux avec l'activité DNase et les SNP DNase
4. Corréler ces données avec des marqueurs de substitution de la taille de l'infarctus, de la reperfusion, des paramètres de résultats à long terme et des facteurs de risque de maladie coronarienne.

Méthodes

Les patients

Les enquêteurs contacteront des patients (n = 400) qui ont été hospitalisés à l'hôpital général de Vienne au cours des 10 dernières années pour un syndrome coronarien aigu avec élévation du segment ST subissant une intervention coronarienne percutanée primaire (pPCI) avec TIMI 0-1. Ces patients seront invités à une consultation. Les enquêteurs effectueront les investigations suivantes avec des patients désireux de rejoindre l'étude :

• Antécédents médicaux
• Examen clinique détaillé
• Électrocardiographie
• Échocardiographie
• Prélèvement sanguin de routine
• Prise de sang pour des expériences de recherche Tout patient présentant des résultats cliniques pertinents sera conduit à une évaluation diagnostique plus approfondie. Les MACE survenant entre l'événement coronarien aigu et sa présence seront interrogés lors de la consultation. Tous les patients seront contactés une fois par an pour évaluer MACE.

Donneurs sains Des échantillons de sang provenant de donneurs sains (n ​​= 400) seront obtenus par prélèvement de sang périphérique dans la veine cubitale. Les proposants seront recrutés par bulletins à l'Hôpital général de Vienne.

Réaction en chaîne par polymérase en temps réel Les cellules seront lysées et l'ADN sera isolé à l'aide d'un kit DNAeasy (Applied Biosystems). L'ADN ou sera analysé pour les SNP de DNase en utilisant des tests d'amorce/sonde (Applied Biosystems). Le système de détection de séquences ABI PRISM 7000 et le logiciel (Applied Biosystems) seront utilisés.

Détermination du marqueur de substitution NET

Nucléosomes Pour la détection des complexes ADN-histones (nucléosomes), un kit de détection de la mort cellulaire ELISA (Roche Diagnostics GmbH, Allemagne) sera utilisé. Les valeurs de densité optique (DO) seront normalisées par rapport au contrôle positif interne et exprimées en unités de nucléosome arbitraires/ml (NU/ml). Le contrôle positif intra-essai est égal à 1000 NU/ml.

Complexes MPO-ADN Les fragments d'ADN associés à la myéloperoxydase (MPO) seront identifiés à l'aide d'un ELISA de capture. Les microplaques 96 puits seront recouvertes d'un anticorps monoclonal de capture anti-MPO (ABD Serotec, UK). Comme anticorps de détection, les chercheurs utiliseront un anticorps monoclonal anti-ADN marqué à la peroxydase (Cell Death Detection ELISA Plus Kit, Roche Diagnostics GmbH, Allemagne). Toutes les mesures seront effectuées en double et les valeurs seront spécifiées en tant que DO moyennes.

ADN double brin Pour la détection de l'ADN double brin (ADNdb) dans le plasma des patients, les chercheurs utiliseront un test d'ADNdb Quant-iT PicoGreen (Invitrogen, USA) sur des microplaques à 96 puits. PicoGreen est un colorant d'acide nucléique fluorescent pour la quantification de l'ADNdb en solution. La fluorescence sera mesurée par un lecteur de microplaques Varioskan Flash (Thermo Scientific, USA) et normalisée à la norme fournie (1000 ng/ml).

Dosage de l'activité de la DNase L'activité endogène de la désoxyribonucléase (DNase) sera mesurée à l'aide d'un dosage de l'activité de la DNase (Orgentec Diagnostika GmbH, Mayence, Allemagne). Une microplaque revêtue d'ADN sera incubée avec des échantillons de plasma pendant 60 minutes. L'ADN revêtu sera dégradé proportionnellement à l'activité DNase de l'échantillon respectif. La densité optique de l'ADN résiduel sera inversement proportionnelle à l'activité DNase. Tous les tests seront effectués en suivant les instructions du fabricant. Toutes les mesures seront effectuées en double. Les plaques seront lues sur un lecteur de microplaques VersaMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Culture de cellules polymorphonucléaires (PMN) et essais de netose PMN (c.-à-d. principalement des neutrophiles) provenant de donneurs sains seront isolés avec Polymorphprep (Axis-Shield, Dundee, Écosse). Les érythrocytes seront lysés à l'aide d'un tampon de lyse en une étape (NH4Cl 154 mmol/L, KHCO3 10 mmol/L, EDTA 0,1 mmol/L). La suspension cellulaire sera ensuite lavée deux fois avec du HBSS additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS). Les PMN isolés seront comptés et remis en suspension à 2x10^6 cellules/ml dans du HBSS additionné de 10 % de FBS. La viabilité cellulaire sera déterminée par exclusion du bleu trypan.

Coloration par immunofluorescence des TNE Les TNE fixées seront colorées à l'aide d'un anticorps de souris anti-ADN Histone H1 (Millipore). Après incubation, un anticorps IgG secondaire d'âne anti-souris couplé à Alexa Fluor 555 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY ; USA) sera ajouté. Pour la détection de l'ADN nucléaire, le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, milieu de montage Vectashield avec DAPI ; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) sera utilisé. Pour la coloration de l'élastase des neutrophiles (NE) et de la myéloperoxydase (MPO), des anticorps de lapin anti-humain NE et MPO (Abcam) sont utilisés avec un anticorps secondaire IgG d'âne anti-lapin couplé Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Les images seront obtenues avec un microscope à fluorescence Axio Imager 2 utilisant AxioVision (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Göttingen, Allemagne).

Statistiques Les données normalement distribuées seront exprimées sous forme de moyenne ± écart type (SD), sinon la médiane et l'intervalle interquartile (IQR) seront présentés. Le test t des étudiants jumelés sera appliqué pour comparer les variables normalement distribuées, sinon le test de rang signé de Wilcoxon sera utilisé. La distribution des données sera testée à l'aide du test de Kolmogorov-Smirnov, du test de Shapiro-Wilk et d'histogrammes (données non présentées). Pour la comparaison de plusieurs groupes, une analyse unidirectionnelle de la variance avec la procédure post-hoc de Scheffé sera effectuée. La corrélation de rang de Spearman (rs) sera appliquée pour calculer les données de corrélations. Des modèles de régression multivariés seront calculés et des techniques de correction bootstrap seront appliquées. L'aire sous la courbe (AUC) des valeurs de CK-MB sera exprimée en unités arbitraires et calculée à l'aide de la formule trapézoïdale (10), si au moins 5 valeurs consécutives sur une période de 3 jours après l'admission étaient disponibles. La correction de Bonferroni-Holm sera utilisée pour les tests multiples. Une valeur de p inférieure à 0,05 sera considérée comme significative. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide d'IBM SPSS Statistics 20.0 pour Windows (New York, NY, États-Unis). Les figures seront générées à l'aide de GraphPad Prism 5.