SNP-er i DNase 1-genet svekker aktiviteten og øker i en STE-ACS-pasientkohort sammenlignet med sunne kontroller

Bakgrunn Akutt koronarsyndrom (ACS) er blant de viktigste dødsårsakene(1). Aterosklerose og koronar trombotisk okklusjon er drevet av inflammatoriske patomekanismer(2). Etterforskerne har vist nøytrofil aktivering og nøytrofile ekstracellulære feller (NET) på den skyldige lesjonsstedet til ST-elevasjons-ACS (STE-ACS)-pasienter(3). NET er godt beskrevne komponenter av tromber, som bygger en kondensasjonskjerne for blodplater, erytrocytter og fibrinogen. NET-holdige tromber kan lyseres effektivt av deoksyribonuklease (DNase) in vitro(4). Ved å tilsette DNase, viste etterforskerne kraftig akselerasjon av vevsplasminogenaktivator-mediert lysis av koronar tromber ex vivo. Surrogatmarkører for NET er sterke prediktorer for akutte koronare hendelser(5). Hos STE-ACS-pasienter korrelerte NET direkte med hjertemagnetresonansmålt infarktstørrelse. Dessuten korrelerte økt koronar DNase-aktivitet med mindre infarktstørrelse(3).

To store endogene plasmatiske DNaser er beskrevet, nemlig DNase 1 og DNase gamma(6). Flere polymorfismer av genet som koder for DNase 1 som påvirker dets aktivitet er kjent(7,8). Enkeltnukleotidpolymorfismen (SNP) Q222R i DNase 1-genet, som førte til nedsatt ekstracellulær DNase-aktivitet, var korrelert med økt forekomst av hjerteinfarkt hos japanske pasienter(9). SNP-er assosiert med redusert DNAse-aktivitet er også kjent for DNase-gamma, men ingen assosiasjoner til ACS har blitt undersøkt. Nåværende data innebærer en kritisk balanse mellom dannelse og degradering av NET og utfallet av ACS.

Begrunnelse Etterforskerne antar at koronar endoluminal NET-dannelse er en hovedkomponent i akutt makro- og mikrokar-aterotrombose. Ekstracellulær DNase degraderer NET, og nedregulerer dermed overveldende NET-dannelse. Nedsatt DNase-aktivitet øker risikoen for ACS. Dermed søker etterforskerne å teste tilstedeværelsen av polymorfismer i DNase-genet som svekker DNase-aktivitet i en STE-ACS-populasjon.

Mål

1. For å sammenligne enkeltnukleotidpolymorfismer i DNase 1- og gamma-genet hos STE-ACS-pasienter, pasienter med koronararteriesykdom og friske kontroller ved bruk av polymerasekjedereaksjon
2. For å teste DNase-aktivitet i plasma fra disse pasientene og friske kontroller og å korrelere det med den respektive genekspresjonstypen
3. For å teste NET-formasjon og NET surrogatmarkører og å korrelere de med DNase-aktivitet og DNase-SNP-er
4. For å korrelere disse dataene med surrogatmarkører for infarktstørrelse, reperfusjon, langsiktige utfallsparametere og risikofaktorer for koronarsykdom.

Metoder

Pasienter

Etterforskerne vil kontakte pasienter (n=400) som har vært innlagt på General Hospital of Vienna de siste 10 årene for ST-elevasjon akutt koronarsyndrom som gjennomgår primær perkutan koronar intervensjon (pPCI) med TIMI 0-1. Disse pasientene vil bli invitert til konsultasjon. Etterforskerne vil utføre følgende undersøkelser med pasienter som er villige til å delta i studien:

• Medisinsk historie
• Detaljert klinisk undersøkelse
• Elektrokardiografi
• Ekkokardiografi
• Rutinemessig blodprøvetaking
• Blodprøver for forskningseksperimenter Enhver pasient med relevante kliniske funn vil bli ledet til videre diagnostisk evaluering. MACE som oppstår mellom den akutte koronarhendelsen til tilstedeværelse vil bli kartlagt ved konsultasjonen. Alle pasienter vil bli kontaktet en gang i året for å vurdere MACE.

Friske givere Blodprøver fra friske givere (n=400) vil bli tatt ved en perifer blodprøve fra cubitalvenen. Probandene vil bli rekruttert av bulletiner i General Hospital of Vienna.

Sanntidspolymerasekjedereaksjon Celler vil bli lysert og DNA vil bli isolert ved hjelp av et DNAeasy-sett (Applied Biosystems). DNA eller vil bli analysert for DNase SNPs ved bruk av primer/probe-analyser (Applied Biosystems). ABI PRISM 7000 sekvensdeteksjonssystem og programvare (Applied Biosystems) vil bli brukt.

NET surrogatmarkørbestemmelse

Nukleosomer For påvisning av DNA-histonkomplekser (nukleosomer), vil et ELISA-celledødsdeteksjonssett (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland) brukes. Verdier for optisk tetthet (OD) vil bli normalisert til den interne positive kontrollen og uttrykt som vilkårlige nukleosomenheter/ml (NU/ml). Den positive intra-analysen er lik 1000 NU/ml.

MPO-DNA-komplekser Myeloperoksidase (MPO)-assosierte DNA-fragmenter vil bli identifisert ved hjelp av en innfangnings-ELISA. 96-brønners mikroplater vil bli belagt med et anti-MPO monoklonalt fangende antistoff (ABD Serotec, Storbritannia). Som deteksjonsantistoff vil etterforskerne bruke et peroksidasemerket anti-DNA monoklonalt antistoff (Cell Death Detection ELISA Plus Kit, Roche Diagnostics GmbH, Tyskland). Alle målinger vil bli utført i duplikater og verdier vil bli spesifisert som gjennomsnittlig OD.

Dobbelttrådet DNA For påvisning av dobbelttrådet DNA (dsDNA) i pasientplasma, vil etterforskerne bruke en Quant-iT PicoGreen dsDNA-analyse (Invitrogen, USA) på 96-brønners mikroplater. PicoGreen er en fluorescerende nukleinsyrefarge for kvantifisering av dsDNA i løsning. Fluorescens vil bli målt med en Varioskan Flash mikroplateleser (Thermo Scientific, USA) og normalisert til standarden som følger med (1000 ng/ml).

DNase-aktivitetsanalyse Endogen deoksyribonuklease (DNase)-aktivitet vil bli målt ved å bruke en DNase-aktivitetsanalyse (Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Tyskland). En DNA-belagt mikroplate vil bli inkubert med plasmaprøver i 60 minutter. Belagt DNA vil bli degradert i forhold til DNase-aktiviteten til den respektive prøven. Optisk tetthet av gjenværende DNA vil være omvendt proporsjonal med DNase-aktivitet. Alle analyser vil bli utført i henhold til produsentens instruksjoner. Alle målinger vil bli utført i duplikat. Platene vil bli lest på en VersaMax mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Polymorfonukleære (PMN) cellekultur- og netoseanalyser PMN-er (dvs. hovedsakelig nøytrofiler) fra friske givere vil bli isolert med Polymorphprep (Axis-Shield, Dundee, Skottland). Erytrocytter vil lyseres ved hjelp av en ett-trinns lyseringsbuffer (NH4Cl 154mmol/L, KHCO3 10mmol/L, EDTA 0,1mmol/L). Cellesuspensjonen vil deretter vaskes to ganger med HBSS supplert med 10 % av føtalt kalveserum (FBS). Isolerte PMN-er vil telles og resuspenderes ved 2x10^6 celler/ml i HBSS supplert med 10 % FBS. Cellelevedyktighet vil bli bestemt ved eksklusjon av trypanblått.

Immunfluorescensfarging av NET Fixed NETs vil bli farget med et mus anti-DNA Histone H1 antistoff (Millipore). Etter inkubering vil et sekundært esel-anti-muse-IgG-antistoff koblet til Alexa Fluor 555 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY; USA) bli lagt til. For påvisning av kjernefysisk DNA vil 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vectashield monteringsmedium med DAPI; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) bli brukt. For farging av nøytrofil elastase (NE) og myeloperoksidase (MPO), brukes kanin anti-human NE og MPO antistoffer (Abcam) med et sekundært Alexa Fluor 488 koblet esel anti-kanin IgG antistoff (Invitrogen). Bilder vil bli tatt med et Axio Imager 2 fluorescensmikroskop ved bruk av AxioVision (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Göttingen, Tyskland).

Statistikk Normalfordelte data vil uttrykkes som gjennomsnitt ± standardavvik (SD), ellers vil median og interkvartilt område (IQR) presenteres. Paret Students t-test vil bli brukt for å sammenligne normalfordelte variabler, ellers vil Wilcoxon signert rangtest bli brukt. Distribusjon av data vil bli testet ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov-testen, Shapiro-Wilk-testen og histogrammer (data ikke vist). For sammenligning av flere grupper vil enveis variansanalyse med post-hoc Scheffé-prosedyre bli utført. Spearmans rangkorrelasjon (rs) vil bli brukt for å beregne korrelasjonsdata. Multivariate regresjonsmodeller vil bli beregnet og bootstrap korreksjonsteknikker vil bli brukt. Arealet under kurven (AUC) av CK-MB-verdier vil uttrykkes i vilkårlige enheter og beregnes ved bruk av trapesformelen (10), dersom minst 5 påfølgende verdier over en periode på 3 dager etter innleggelse var tilgjengelig. Bonferroni-Holm-korreksjon vil bli brukt for flere tester. En p-verdi under 0,05 vil anses som signifikant. Statistiske analyser ble utført ved bruk av IBM SPSS Statistics 20.0 for Windows (New York, NY, USA). Figurer vil bli generert ved hjelp av GraphPad Prism 5.