SNPs no gene DNase 1 prejudicam sua atividade e são aumentados em uma coorte de pacientes com STE-ACS em comparação com controles saudáveis

Contexto A síndrome coronariana aguda (SCA) está entre as principais causas de morte(1). A aterosclerose e a oclusão trombótica coronariana são impulsionadas por mecanismos patogênicos inflamatórios(2). Os investigadores demonstraram ativação neutrofílica e armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) no local da lesão culpada de pacientes com SCA com elevação do segmento ST (STE-ACS)(3). Os NETs são componentes bem descritos de trombos, formando um núcleo de condensação para plaquetas, eritrócitos e fibrinogênio. Trombos contendo NET podem ser efetivamente lisados ​​pela desoxirribonuclease (DNase) in vitro(4). Ao adicionar DNase, os investigadores mostraram aceleração potente da lise mediada por ativador de plasminogênio tecidual de trombos coronários ex vivo. Marcadores substitutos de TNEs são fortes preditores de eventos coronarianos agudos(5). Em pacientes com STE-ACS, os NETs correlacionaram-se diretamente com o tamanho do infarto medido por ressonância magnética cardíaca. Além disso, o aumento da atividade da DNase coronariana se correlacionou com o tamanho menor do infarto(3).

Duas principais DNases endógenas plasmáticas foram descritas, a saber, DNase 1 e DNase gama(6). Vários polimorfismos do gene que codifica a DNase 1 afetando sua atividade são conhecidos(7,8). O polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) Q222R no gene da DNase 1, levando ao comprometimento da atividade extracelular da DNase, foi correlacionado com o aumento da incidência de infarto do miocárdio em pacientes japoneses(9). SNPs associados com atividade reduzida de DNAse também são conhecidos para DNase gama, mas nenhuma associação com ACS foi investigada. Os dados atuais implicam um equilíbrio crítico entre formação e degradação de NETs e resultado de ACS.

Justificativa Os investigadores levantam a hipótese de que a formação de NET endoluminal coronariano é um componente importante da aterotrombose aguda de macro e microvasos. A DNase extracelular degrada NETs, ​​regulando negativamente a formação de NETs avassaladoras. A atividade prejudicada da DNase aumenta o risco de SCA. Assim, os investigadores procuram testar a presença de polimorfismos no gene da DNase prejudicando a atividade da DNase em uma população de STE-ACS.

Mira

1. Comparar polimorfismos de nucleotídeo único no gene DNase 1 e gama em pacientes com STE-ACS, pacientes com doença arterial coronariana e controles saudáveis ​​usando reação em cadeia da polimerase
2. Testar a atividade da DNase no plasma desses pacientes e controles saudáveis ​​e correlacioná-la com o respectivo tipo de expressão gênica
3. Testar a formação de NET e marcadores substitutos de NET e correlacionar aqueles com atividade de DNase e SNPs de DNase
4. Correlacionar esses dados com marcadores substitutos do tamanho do infarto, reperfusão, parâmetros de resultados de longo prazo e fatores de risco para doença arterial coronariana.

Métodos

Pacientes

Os investigadores entrarão em contato com pacientes (n=400) que foram hospitalizados no Hospital Geral de Viena nos últimos 10 anos por síndrome coronariana aguda com elevação do segmento ST submetidos a intervenção coronária percutânea primária (pPCI) com TIMI 0-1. Esses pacientes serão convidados para uma consulta. Os investigadores realizarão as seguintes investigações com pacientes dispostos a participar do estudo:

• Histórico médico
• Exame clínico detalhado
• Eletrocardiografia
• Ecocardiografia
• Coleta de sangue de rotina
• Coleta de sangue para experimentos de pesquisa Qualquer paciente com achados clínicos relevantes será conduzido a uma avaliação diagnóstica adicional. Os MACE ocorridos entre o evento coronariano agudo até a presença serão pesquisados ​​na consulta. Todos os pacientes serão contatados uma vez por ano para avaliar MACE.

Doadores saudáveis ​​Amostras de sangue de doadores saudáveis ​​(n=400) serão obtidas por coleta de sangue periférico da veia cubital. Os probandos serão recrutados por boletins no Hospital Geral de Viena.

Reação em cadeia da polimerase em tempo real As células serão lisadas e o DNA será isolado usando um kit DNAeasy (Applied Biosystems). DNA ou serão analisados ​​para DNase SNPs usando ensaios de primer/sonda (Applied Biosystems). Serão utilizados o Sistema de Detecção de Sequências ABI PRISM 7000 e o software (Applied Biosystems).

Determinação do marcador substituto NET

Nucleossomos Para a detecção dos complexos DNA-histona (nucleossomos), será utilizado o kit ELISA-Cell death detection kit (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha). Os valores de densidade óptica (OD) serão normalizados para o controle positivo interno e expressos como unidades arbitrárias de nucleossomo/ml (NU/ml). O controle positivo intra-ensaio é igual a 1000 NU/ml.

Complexos MPO-DNA Os fragmentos de DNA associados à mieloperoxidase (MPO) serão identificados por ELISA de captura. Microplacas de 96 poços serão revestidas com um anticorpo de captura monoclonal anti-MPO (ABD Serotec, Reino Unido). Como anticorpo de detecção, os investigadores usarão um anticorpo monoclonal anti-DNA marcado com peroxidase (Cell Death Detection ELISA Plus Kit, Roche Diagnostics GmbH, Alemanha). Todas as medições serão realizadas em duplicata e os valores serão especificados como DOs médios.

DNA de fita dupla Para a detecção de DNA de fita dupla (dsDNA) no plasma do paciente, os investigadores empregarão um ensaio Quant-iT PicoGreen dsDNA (Invitrogen, EUA) em microplacas de 96 poços. PicoGreen é uma coloração de ácido nucleico fluorescente para a quantificação de dsDNA em solução. A fluorescência será medida por um leitor de microplacas Varioskan Flash (Thermo Scientific, EUA) e normalizada para o padrão fornecido (1000 ng/ml).

Ensaio de atividade de DNase A atividade de desoxirribonuclease endógena (DNase) será medida empregando um ensaio de atividade de DNase (Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Alemanha). Uma microplaca revestida com DNA será incubada com amostras de plasma por 60 minutos. O DNA revestido será degradado proporcionalmente à atividade de DNase da respectiva amostra. A densidade óptica do DNA residual será inversamente proporcional à atividade da DNase. Todos os ensaios serão realizados seguindo as instruções do fabricante. Todas as medições serão realizadas em duplicata. As placas serão lidas em um leitor de microplacas VersaMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA).

Cultura de células polimorfonucleares (PMN) e ensaios de netose PMNs (i.e. principalmente neutrófilos) de doadores saudáveis ​​serão isolados com Polymorphprep (Axis-Shield, Dundee, Escócia). Os eritrócitos serão lisados ​​usando um tampão de lise de uma etapa (NH4Cl 154mmol/L, KHCO3 10mmol/L, EDTA 0,1mmol/L). A suspensão de células será então lavada duas vezes com HBSS suplementado com 10% de soro fetal de vitela (FBS). Os PMNs isolados serão contados e ressuspensos a 2x10^6 células/ml em HBSS suplementado com 10% de FBS. A viabilidade celular será determinada por exclusão de azul de tripano.

Coloração de imunofluorescência de NETs Os NETs fixos serão corados usando um anticorpo de camundongo anti-DNA Histona H1 (Millipore). Após a incubação, será adicionado um anticorpo IgG anti-camundongo burro secundário acoplado a Alexa Fluor 555 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY; EUA). Para detecção de DNA nuclear, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, meio de montagem Vectashield com DAPI; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) será usado. Para a coloração de elastase de neutrófilos (NE) e mieloperoxidase (MPO), os anticorpos NE e MPO anti-humanos de coelho (Abcam) são usados ​​com um anticorpo IgG anti-coelho Alexa Fluor 488 secundário acoplado (Invitrogen). As imagens serão obtidas com um microscópio de fluorescência Axio Imager 2 usando AxioVision (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Göttingen, Alemanha).

Estatística Dados normalmente distribuídos serão expressos como média ± desvio padrão (DP), caso contrário, mediana e intervalo interquartílico (IQR) serão apresentados. O teste t de Student pareado será aplicado para comparar variáveis ​​normalmente distribuídas, caso contrário, será usado o teste de posto sinalizado de Wilcoxon. A distribuição dos dados será testada usando o teste de Kolmogorov-Smirnov, o teste de Shapiro-Wilk e histogramas (dados não mostrados). Para comparação de grupos múltiplos, será realizada análise de variância unidirecional com procedimento post-hoc de Scheffé. A correlação de classificação de Spearman (rs) será aplicada para calcular os dados de correlação. Modelos de regressão multivariada serão calculados e técnicas de correção bootstrap serão aplicadas. A área sob a curva (AUC) dos valores de CK-MB será expressa em unidades arbitrárias e será calculada empregando a fórmula trapezoidal (10), se pelo menos 5 valores consecutivos durante um período de 3 dias após a admissão estiverem disponíveis. A correção de Bonferroni-Holm será usada para testes múltiplos. Um valor de p abaixo de 0,05 será considerado significativo. As análises estatísticas foram realizadas usando o IBM SPSS Statistics 20.0 for Windows (Nova York, NY, EUA). As figuras serão geradas usando o GraphPad Prism 5.