DNase 1 유전자의 SNP는 건강한 대조군에 비해 STE-ACS 환자 코호트에서 활성을 손상시키고 증가합니다.

배경 급성 관상동맥 증후군(ACS)은 주요 사망 원인 중 하나입니다(1). 죽상동맥경화증과 관상동맥 혈전성 폐색은 염증성 기전(2)에 의해 유발됩니다. 연구자들은 ST-상승 ACS(STE-ACS) 환자의 범인 병변 부위에서 호중구 활성화 및 호중구 세포외 트랩(NETs)을 보여주었습니다(3). NET은 혈소판, 적혈구 및 피브리노겐을 위한 응축 핵을 구축하는 혈전의 구성 요소로 잘 설명되어 있습니다. NET 함유 혈전은 시험관 내에서 데옥시리보뉴클레아제(DNase)에 의해 효과적으로 용해될 수 있습니다(4). DNase를 추가함으로써 조사자들은 조직 플라스미노겐 활성제-매개 관상 동맥 혈전 용해의 강력한 가속을 생체 외에서 보여주었다. NET의 대리 마커는 급성 관상 동맥 사건의 강력한 예측 인자입니다(5). STE-ACS 환자에서 NET은 심장 자기 공명 측정 경색 크기와 직접적으로 관련이 있습니다. 더욱이, 증가된 관상 동맥 DNase 활성은 더 작은 경색 크기와 관련이 있습니다(3).

두 가지 주요 내인성 플라즈마 DNases, 즉 DNase 1 및 DNase gamma(6)가 설명되었습니다. 그 활성에 영향을 미치는 DNase 1을 암호화하는 유전자의 여러 다형성이 알려져 있습니다(7,8). DNase 1 유전자의 SNP(single nucleotide polymorphism) Q222R은 손상된 세포외 DNase 활성을 유발하며 일본인 환자의 심근경색 발병률 증가와 관련이 있습니다(9). 감소된 DNAse 활성과 관련된 SNP는 DNase 감마에 대해서도 알려져 있지만 ACS와의 연관성은 조사되지 않았습니다. 현재 데이터는 NET의 형성 및 저하와 ACS의 결과 사이의 중요한 균형을 의미합니다.

이론적 근거 연구자들은 관상 동맥 관내 NET 형성이 급성 대혈관 및 미세혈관 죽상혈전증의 주요 구성 요소라는 가설을 세웁니다. 세포 외 DNase는 NET을 분해하여 압도적인 NET 형성을 하향 조절합니다. 손상된 DNase 활동은 ACS의 위험을 증가시킵니다. 따라서 연구자들은 STE-ACS 모집단에서 DNase 활성을 손상시키는 DNase 유전자의 다형성의 존재를 테스트하려고 합니다.

목표

1. STE-ACS 환자, 관상 동맥 질환 환자 및 건강한 대조군에서 DNase 1 및 감마 유전자의 단일 염기 다형성을 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 비교하기 위해
2. 이들 환자와 건강한 대조군의 혈장에서 DNase 활성을 테스트하고 이를 각각의 유전자 발현 유형과 연관시키기 위해
3. NET 형성 및 NET 대체 마커를 테스트하고 이들을 DNase 활성 및 DNase SNP와 연관시키기 위해
4. 이러한 데이터를 경색 크기, 재관류, 장기 결과 매개 변수 및 관상 동맥 질환에 대한 위험 인자의 대리 마커와 연관시킵니다.

행동 양식

환자

연구자들은 TIMI 0-1로 1차 경피 관상동맥 중재술(pPCI)을 받는 ST 상승 급성 관상동맥 증후군으로 지난 10년 동안 비엔나 종합병원에 입원한 환자(n=400)에게 연락할 것입니다. 이 환자들은 상담을 위해 초대됩니다. 조사관은 연구에 참여할 의향이 있는 환자를 대상으로 다음과 같은 조사를 수행합니다.

• 병력
• 자세한 임상 검사
• 심전도
• 심초음파
• 일상적인 채혈
• 연구 실험을 위한 채혈 관련 임상 결과가 있는 모든 환자는 추가 진단 평가를 받게 됩니다. 급성 관상 동맥 사건 사이에 발생하는 MACE는 상담 시 존재 여부를 조사합니다. 모든 환자는 MACE를 평가하기 위해 1년에 한 번 연락을 받게 됩니다.

건강한 기증자 건강한 기증자(n=400)의 혈액 샘플은 팔정맥에서 말초 혈액을 채취하여 얻습니다. 발의자는 비엔나 종합 병원의 게시판에서 모집합니다.

실시간 중합효소연쇄반응 세포가 용해되고 DNAeasy 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 DNA가 분리됩니다. DNA는 프라이머/프로브 분석(Applied Biosystems)을 사용하여 DNase SNP에 대해 분석됩니다. ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템 및 소프트웨어(Applied Biosystems)가 사용됩니다.

NET 대리 마커 결정

뉴클레오솜 DNA-히스톤 복합체(뉴클레오솜) 검출을 위해 ELISA-Cell death detection kit(Roche Diagnostics GmbH, Germany)를 사용합니다. 광학 밀도(OD) 값은 내부 양성 대조군으로 정규화되고 임의의 뉴클레오솜 단위/ml(NU/ml)로 표시됩니다. 분석 내 양성 대조군은 1000 NU/ml입니다.

MPO-DNA 복합체 MPO(Myeloperoxidase) 관련 DNA 단편은 캡처 ELISA를 사용하여 식별됩니다. 96-웰 마이크로플레이트는 항-MPO 단일클론 포획 항체(ABD Serotec, UK)로 코팅될 것입니다. 검출 항체로서 조사자는 과산화효소 표지된 항-DNA 단일클론 항체(Cell Death Detection ELISA Plus Kit, Roche Diagnostics GmbH, Germany)를 사용할 것이다. 모든 측정은 중복으로 수행되며 값은 평균 OD로 지정됩니다.

이중 가닥 DNA 환자 혈장에서 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 검출하기 위해 조사관은 96-웰 마이크로플레이트에서 Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석(Invitrogen, USA)을 사용합니다. PicoGreen은 용액 내 dsDNA 정량화를 위한 형광 핵산 염색제입니다. 형광은 Varioskan Flash 마이크로플레이트 판독기(Thermo Scientific, USA)로 측정하고 제공된 표준(1000 ng/ml)으로 정규화합니다.

DNase 활성 검정 내인성 데옥시리보뉴클레아제(DNase) 활성은 DNase 활성 검정(Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Germany)을 사용하여 측정될 것이다. DNA 코팅된 마이크로플레이트는 60분 동안 혈장 샘플과 함께 배양됩니다. 코팅된 DNA는 각 샘플의 DNase 활성에 비례하여 분해됩니다. 잔류 DNA의 광학 밀도는 DNase 활성에 반비례합니다. 모든 분석은 제조업체의 지침에 따라 수행됩니다. 모든 측정은 이중으로 수행됩니다. 플레이트는 VersaMax 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)에서 판독됩니다.

다형핵(PMN) 세포 배양 및 그물증 분석 건강한 기증자의 주로 호중구)는 Polymorphprep(Axis-Shield, Dundee, Scotland)으로 분리됩니다. 적혈구는 1단계 용해 완충액(NH4Cl 154mmol/L, KHCO3 10mmol/L, EDTA 0.1mmol/L)을 사용하여 용해됩니다. 그런 다음 세포 현탁액을 10% 태아 송아지 혈청(FBS)이 보충된 HBSS로 두 번 세척합니다. 분리된 PMN은 계산되고 10% FBS가 보충된 HBSS에서 2x10^6 세포/ml로 재현탁됩니다. 세포 생존력은 트리판 블루 배제에 의해 결정됩니다.

NET의 면역형광 염색 고정된 NET은 마우스 항-DNA 히스톤 H1 항체(Millipore)를 사용하여 염색됩니다. 인큐베이션 후, Alexa Fluor 555(Invitrogen, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 Life Technologies)에 결합된 2차 당나귀 항-마우스 IgG 항체가 추가될 것이다. 핵 DNA 검출을 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, DAPI가 포함된 Vectashield 장착 매체; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)가 사용됩니다. 호중구 엘라스타제(NE) 및 골수페록시다제(MPO)의 염색을 위해 토끼 항인간 NE 및 MPO 항체(Abcam)를 이차 Alexa Fluor 488 결합 당나귀 항토끼 IgG 항체(Invitrogen)와 함께 사용합니다. 이미지는 AxioVision(Carl Zeiss Microscopy GmbH, Göttingen, Germany)을 사용하는 Axio Imager 2 형광 현미경으로 얻을 수 있습니다.

통계 일반적으로 분포된 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현되며, 그렇지 않은 경우 중앙값 및 사분위수 범위(IQR)가 표시됩니다. 짝을 이룬 학생 t-테스트는 정규 분포 변수를 비교하는 데 적용되며, 그렇지 않으면 Wilcoxon 부호 순위 테스트가 사용됩니다. 데이터 분포는 Kolmogorov-Smirnov 테스트, Shapiro-Wilk 테스트 및 히스토그램(데이터는 표시되지 않음)을 사용하여 테스트됩니다. 여러 그룹의 비교를 위해 사후 Scheffé 절차를 사용한 편도 분산 분석이 수행됩니다. 상관 데이터를 계산하기 위해 Spearman의 순위 상관(rs)이 적용됩니다. 다변량 회귀 모델이 계산되고 부트스트랩 수정 기술이 적용됩니다. CK-MB 값의 곡선 아래 면적(AUC)은 임의 단위로 표시되며, 입원 후 3일 동안 최소 5개의 연속 값을 사용할 수 있는 경우 사다리꼴 공식(10)을 사용하여 계산됩니다. Bonferroni-Holm 보정은 다중 테스트에 사용됩니다. 0.05 미만의 p-값은 유의한 것으로 간주됩니다. Windows용 IBM SPSS Statistics 20.0(뉴욕, 뉴욕, 미국)을 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 수치는 GraphPad Prism 5를 사용하여 생성됩니다.