Los SNP en el gen de la ADNasa 1 deterioran su actividad y aumentan en una cohorte de pacientes con STE-ACS en comparación con controles sanos

Antecedentes El síndrome coronario agudo (SCA) se encuentra entre las principales causas de muerte(1). La aterosclerosis y la oclusión trombótica coronaria son impulsadas por mecanismos patogénicos inflamatorios(2). Los investigadores han mostrado activación de neutrófilos y trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en el sitio de la lesión culpable de pacientes con SCA con elevación del ST (STE-ACS) (3). Los NET son componentes bien descritos de trombos, que construyen un núcleo de condensación para plaquetas, eritrocitos y fibrinógeno. Los trombos que contienen NET se pueden lisar de forma eficaz mediante la desoxirribonucleasa (DNasa) in vitro(4). Al agregar ADNasa, los investigadores demostraron una potente aceleración de la lisis mediada por el activador del plasminógeno tisular de los trombos coronarios ex vivo. Los marcadores sustitutos de los TNE son fuertes predictores de eventos coronarios agudos(5). En pacientes con STE-SCA, los NET se correlacionaron directamente con el tamaño del infarto medido por resonancia magnética cardíaca. Además, el aumento de la actividad de la DNasa coronaria se correlacionó con un tamaño más pequeño del infarto (3).

Se han descrito dos ADNasas plasmáticas endógenas principales, a saber, la ADNasa 1 y la ADNasa gamma(6). Se conocen varios polimorfismos del gen que codifica para la DNasa 1 que afectan su actividad (7,8). El polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) Q222R en el gen de la ADNasa 1, que conduce a una alteración de la actividad de la ADNasa extracelular, se correlacionó con una mayor incidencia de infarto de miocardio en pacientes japoneses(9). Los SNP asociados con una actividad de ADNasa reducida también se conocen para la ADNasa gamma, pero no se han investigado asociaciones con ACS. Los datos actuales implican un equilibrio crítico entre la formación y degradación de NET y el resultado de ACS.

Justificación Los investigadores plantean la hipótesis de que la formación de NET endoluminales coronarios es un componente importante de la aterotrombosis aguda de macro y microvasos. La ADNasa extracelular degrada los NET y, por lo tanto, regula a la baja la abrumadora formación de NET. La actividad alterada de la ADNasa aumenta el riesgo de SCA. Por lo tanto, los investigadores buscan probar la presencia de polimorfismos en el gen de la ADNasa que altera la actividad de la ADNasa en una población STE-ACS.

Objetivos

1. Comparar polimorfismos de un solo nucleótido en el gen DNasa 1 y gamma en pacientes con STE-SCA, pacientes con enfermedad arterial coronaria y controles sanos usando la reacción en cadena de la polimerasa
2. Para probar la actividad de la ADNasa en el plasma de estos pacientes y controles sanos y correlacionarla con el tipo de expresión génica respectiva
3. Para probar la formación de NET y los marcadores sustitutos de NET y correlacionarlos con la actividad de DNasa y los SNP de DNasa
4. Correlacionar estos datos con marcadores sustitutos del tamaño del infarto, reperfusión, parámetros de resultados a largo plazo y factores de riesgo de enfermedad arterial coronaria.

Métodos

Pacientes

Los investigadores se pondrán en contacto con pacientes (n=400) que hayan sido hospitalizados en el Hospital General de Viena en los últimos 10 años por síndrome coronario agudo con elevación del segmento ST sometidos a intervención coronaria percutánea primaria (pPCI) con TIMI 0-1. Estos pacientes serán invitados a una consulta. Los investigadores realizarán las siguientes investigaciones con los pacientes que deseen participar en el estudio:

• Historial médico
• Examen clínico detallado
• Electrocardiografía
• Ecocardiografía
• Extracción de sangre de rutina
• Extracción de sangre para experimentos de investigación Cualquier paciente con hallazgos clínicos relevantes será llevado a una evaluación diagnóstica adicional. MACE ocurrido entre el evento coronario agudo hasta la presencia será encuestado en la consulta. Todos los pacientes serán contactados una vez al año para evaluar MACE.

Donantes sanos Las muestras de sangre de donantes sanos (n=400) se obtendrán mediante una extracción de sangre periférica de la vena cubital. Los probandos serán reclutados por boletines en el Hospital General de Viena.

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real Se lisarán las células y se aislará el ADN utilizando un kit DNAeasy (Applied Biosystems). El ADN o se analizará en busca de SNP de ADNasa utilizando ensayos de cebador/sonda (Applied Biosystems). Se utilizará el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7000 y el software (Applied Biosystems).

Determinación de marcador sustituto NET

Nucleosomas Para la detección de complejos de histonas de ADN (nucleosomas), se empleará un kit de detección de muerte celular ELISA (Roche Diagnostics GmbH, Alemania). Los valores de densidad óptica (DO) se normalizarán con respecto al control positivo interno y se expresarán como unidades de nucleosoma arbitrarias/ml (NU/ml). El control positivo intraensayo es igual a 1000 NU/ml.

Complejos MPO-ADN Los fragmentos de ADN asociados a la mieloperoxidasa (MPO) se identificarán mediante un ELISA de captura. Las microplacas de 96 pocillos se recubrirán con un anticuerpo de captura monoclonal anti-MPO (ABD Serotec, Reino Unido). Como anticuerpo de detección, los investigadores utilizarán un anticuerpo monoclonal anti-ADN marcado con peroxidasa (Cell Death Detection ELISA Plus Kit, Roche Diagnostics GmbH, Alemania). Todas las mediciones se realizarán por duplicado y los valores se especificarán como DO medias.

ADN de doble cadena Para la detección de ADN de doble cadena (dsDNA) en el plasma del paciente, los investigadores emplearán un ensayo Quant-iT PicoGreen dsDNA (Invitrogen, EE. UU.) en microplacas de 96 pocillos. PicoGreen es una tinción de ácido nucleico fluorescente para la cuantificación de dsDNA en solución. La fluorescencia se medirá con un lector de microplacas Varioskan Flash (Thermo Scientific, EE. UU.) y se normalizará al estándar proporcionado (1000 ng/ml).

Ensayo de actividad de DNasa La actividad de desoxirribonucleasa (DNasa) endógena se medirá mediante un ensayo de actividad de DNasa (Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Alemania). Una microplaca recubierta de ADN se incubará con muestras de plasma durante 60 minutos. El ADN recubierto se degradará en proporción a la actividad de ADNasa de la muestra respectiva. La densidad óptica del ADN residual será inversamente proporcional a la actividad de la ADNasa. Todos los ensayos se realizarán siguiendo las instrucciones del fabricante. Todas las mediciones se realizarán por duplicado. Las placas se leerán en un lector de microplacas VersaMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.).

Cultivo de células polimorfonucleares (PMN) y ensayos de netosis PMN (es decir, principalmente neutrófilos) de donantes sanos se aislarán con Polymorphprep (Axis-Shield, Dundee, Escocia). Los eritrocitos se lisarán utilizando un tampón de lisis de un solo paso (NH4Cl 154mmol/L, KHCO3 10mmol/L, EDTA 0,1mmol/L). A continuación, la suspensión celular se lavará dos veces con HBSS suplementado con un 10 % de suero de ternera fetal (FBS). Los PMN aislados se contarán y resuspenderán a 2x10^6 células/ml en HBSS suplementado con 10 % de FBS. La viabilidad celular se determinará por exclusión con azul de tripán.

Tinción de inmunofluorescencia de NET Los NET fijados se tiñerán con un anticuerpo de ratón anti-ADN histona H1 (Millipore). Después de la incubación, se agregará un anticuerpo secundario IgG anti-ratón de burro acoplado a Alexa Fluor 555 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY; EE. UU.). Para la detección de ADN nuclear, se utilizará 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, medio de montaje Vectashield con DAPI; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.). Para la tinción de elastasa de neutrófilos (NE) y mieloperoxidasa (MPO), se utilizan anticuerpos anti-NE y MPO humanos de conejo (Abcam) con un anticuerpo IgG anti-conejo de burro acoplado con Alexa Fluor 488 secundario (Invitrogen). Las imágenes se obtendrán con un microscopio de fluorescencia Axio Imager 2 utilizando AxioVision (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Göttingen, Alemania).

Estadísticas Los datos normalmente distribuidos se expresarán como media ± desviación estándar (SD), de lo contrario, se presentarán la mediana y el rango intercuartílico (IQR). Se aplicará la prueba t de Student emparejado para comparar variables distribuidas normalmente; de ​​lo contrario, se utilizará la prueba de rango con signo de Wilcoxon. La distribución de datos se probará utilizando la prueba de Kolmogorov-Smirnov, la prueba de Shapiro-Wilk e histogramas (datos no mostrados). Para la comparación de múltiples grupos, se realizará un análisis de varianza unidireccional con el procedimiento de Scheffé post-hoc. Se aplicará la correlación de rango de Spearman (rs) para calcular los datos de correlación. Se calcularán modelos de regresión multivariante y se aplicarán técnicas de corrección bootstrap. El área bajo la curva (AUC) de los valores de CK-MB se expresará en unidades arbitrarias y se calculará empleando la fórmula trapezoidal (10), si se dispone de al menos 5 valores consecutivos durante un período de 3 días posteriores al ingreso. La corrección de Bonferroni-Holm se utilizará para múltiples pruebas. Un valor de p por debajo de 0,05 se considerará significativo. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando IBM SPSS Statistics 20.0 para Windows (Nueva York, NY, EE. UU.). Las figuras se generarán usando GraphPad Prism 5.