Impact de l'inhibition de la NOS, de la COX et de la ROS sur la régulation du flux sanguin cérébral

Objectifs spécifiques :

1A. Déterminer les contributions indépendantes de NOS et COX à la vasodilatation hypoxique et hypercapnique dans le MCA de jeunes adultes en bonne santé.

1B. Déterminer la contribution combinée de NOS et COX à la vasodilatation hypoxique et hypercapnique dans le MCA de jeunes adultes en bonne santé.

1. C. Déterminer la contribution combinée de NOS, COX et ROS à la vasodilatation hypoxique et hypercapnique dans le MCA de jeunes adultes en bonne santé.
2. A. Déterminer les contributions indépendantes de NOS et COX à la vasodilatation hypoxique et hypercapnique dans le BA de jeunes adultes en bonne santé.

2B. Déterminer la contribution combinée de NOS et COX à la vasodilatation hypoxique et hypercapnique dans le BA de jeunes adultes en bonne santé.

2C. Déterminer la contribution combinée de NOS, COX et ROS à la vasodilatation hypoxique et hypercapnique dans le BA de jeunes adultes en bonne santé.

Sélection initiale : un questionnaire de sélection téléphonique déterminera si les sujets potentiels répondent ou non aux critères d'éligibilité préliminaires. Les sujets potentiellement éligibles seront invités à un examen supplémentaire en personne. Les sujets devront venir à la visite de dépistage à jeun (sauf l'eau) pendant au moins 10 heures.

Les procédures de dépistage en laboratoire comprennent :

1. Consentement éclairé
2. Questionnaire sur les antécédents médicaux
3. Questionnaire sur l'activité physique
4. Test de grossesse urinaire (femmes uniquement)
5. Prise de sang veineux
6. Scan DEXA (absorptiométrie à rayons X à double énergie)

Conception de l'étude : les sujets éligibles effectueront 2 visites d'étude examinant les réponses hypoxiques et hypercapniques dans quatre conditions : contrôle, inhibition de la NOS ou inhibition de la COX, inhibition de la NOS et de la COX et inhibition de la NOS, de la COX et de la ROS. Au cours de la visite 1, les sujets recevront du L-NMMA (NG-monométhyl-L-arginine ; inhibition de la NOS), du kétorolac (inhibition de la COX), puis de l'acide ascorbique (inhibition de la ROS). Lors de la visite 2, les sujets recevront du kétorolac, du L-NMMA, puis de l'acide ascorbique. Les visites d'étude seront effectuées dans un ordre randomisé et contrebalancé et tous les médicaments seront perfusés par voie intraveineuse. L'hypoxie provoquera une SPO2 d'environ 80 %, déterminée par oxymétrie de pouls, et l'hypercapnie augmentera le CO2 de fin d'expiration (PETCO2) d'environ 10 mmHg par rapport à la ligne de base. Tout au long de chaque visite, les sujets seront surveillés pour la fréquence cardiaque, la pression artérielle, la saturation en oxygène de l'oxymétrie de pouls, les gaz respiratoires, la ventilation et la vitesse CBF. Après l'instrumentation et la collecte des données de base, les essais hypoxiques et hypercapniques commenceront avec l'enregistrement de la vitesse de l'artère cérébrale moyenne (MCAv), de la vitesse de l'artère basilaire (BAv), des variables respiratoires et cardiovasculaires. Tous les essais seront séparés par 10 minutes de repos tranquille tout en respirant l'air ambiant et ne seront pas randomisés en raison de l'ordre et du moment des perfusions de médicaments nécessaires pour explorer nos objectifs. En raison de la difficulté d'insonoriser le BA, cela servira d'objectif exploratoire et non considéré comme un résultat nécessaire pour l'achèvement de l'étude.

Méthodes expérimentales et plan d'intervention :

L'échographie Doppler transcrânienne (TCD) MCAv sera mesurée via la fenêtre transtemporelle tandis que la BAv sera mesurée à travers la fenêtre transforaminale avec des sondes d'échographie Doppler transcrânienne de 2 MHz (mégahertz). Chez environ 30 % des individus, la BA ne peut pas être identifiée ; par conséquent, l'insonation de la MCA seule sera jugée suffisante pour poursuivre l'étude dans les cas où BA ne peut pas être localisé.

Mesures La taille et le poids seront mesurés pour calculer l'indice de masse corporelle (IMC). Le tour de taille et de hanche sera mesuré comme indicateur de l'adiposité régionale. Le scan DEXA sera utilisé pour déterminer la composition corporelle. Des échantillons de sang veineux seront obtenus pour la détermination des valeurs chimiques du sang. Au cours de chaque visite, les sujets seront étudiés en position semi-allongée et instrumentés pour la mesure continue de la fréquence cardiaque (ECG à 3 dérivations), de la saturation en oxygène de l'oxymétrie de pouls (SPO2, oxymètre de pouls) et de la pression artérielle (MABP, moniteur physiologique automatisé) . Les paramètres hémodynamiques seront mesurés en continu par pléthysmographie digitale. Les gaz inspiratoires et expiratoires seront mesurés avec un analyseur de gaz et le débit respiratoire sera déterminé avec un pneumotachomètre chauffé.

Hypoxie L'hypoxie sera utilisée pour provoquer une vasodilatation cérébrale dans des conditions de repos et de semi-couché. Trois essais d'hypoxie isocapnique seront effectués par visite d'étude. Les sujets inspireront à travers une valve à deux voies sans réinspiration, connectée à un mélangeur de gaz, alimenté par de l'oxygène sous pression de qualité médicale (O2), du dioxyde de carbone (CO2) et de l'azote (N2). Après 3 minutes de respiration d'air ambiant de base, l'hypoxie sera introduite en diminuant l'O2 inspiré (~ 11 % d'O2) pour susciter et maintenir 3 minutes de SPO2 ~ 80 %, tel que déterminé par un oxymètre de pouls. Après 3 minutes d'hypoxie à l'état d'équilibre de base, il y aura une période de chargement de médicament de 5 minutes (L-NMMA, kétoroloc ou acide ascorbique), suivie d'une période d'entretien de médicament de 5 minutes. L'hypoxie sera maintenue pendant cette période, avec une durée totale d'hypoxie d'environ 15 minutes pour chaque essai d'hypoxie. L'isocapnie sera obtenue grâce à l'ajout de CO2 au gaz inspiré. Le CO2 de fin d'expiration (PETCO2) s'est avéré être un prédicteur valide des niveaux de CO2 dans le sang artériel. Les données antérieures de notre laboratoire indiquent que l'hypoxie à l'état d'équilibre est atteinte en 3 minutes. De plus, l'hypoxie provoquant une SPO2 ~ 80 % sera examinée car les vaisseaux cérébraux ont une sensibilité cérébrovasculaire relativement faible à une hypoxie moins sévère (SPO2 ~ 90 %). Un total de 3 essais d'hypoxie seront menés par visite d'étude, produisant environ 45 minutes d'hypoxie à l'état d'équilibre.

Hypercapnie Une augmentation du CO2 systémique est un signal puissant pour augmenter le flux sanguin dans la circulation cérébrale. Un total de 4 essais hypercapniques seront effectués lors de chaque visite d'étude. Les sujets inspireront à travers une valve de réinspiration coulissante à trois voies attachée à un ballonnet en latex contenant un mélange de gaz hyperoxique (O2 = 40%), hypercapnique (CO2 = 3%) avec le reste N2. Le ballon sera rempli à un volume dépassant la capacité vitale estimée (telle que déterminée par l'âge, le sexe et la taille) de 1 litre. Après 3 minutes de respiration à l'air ambiant de base, l'hypercapnie commencera en faisant glisser la valve de réinhalation à trois voies de l'air ambiant vers le ballonnet en latex attaché. Pendant l'hypercapnie, la PETCO2 augmente (~10 mmHg au-dessus des valeurs de base), mais l'O2 inspiré ne tombe pas en dessous du pourcentage d'air ambiant de 21 %. L'hypercapnie sera maintenue (~ 2 minutes) jusqu'à ce que les valeurs de PETCO2 atteignent ~ 10 mmHg au-dessus des valeurs de base, après quoi le sujet commencera à respirer l'air ambiant. Le PETCO2 sera utilisé comme mesure fiable et non invasive du CO2 artériel. Un total de 4 essais hypercapniques seront menés par visite d'étude, ce qui donnera environ 8 minutes d'hypercapnie par visite d'étude.

Cathéter intraveineux Le personnel de laboratoire formé placera deux cathéters intraveineux (un dans chaque bras) pour chaque visite d'étude. Un cathéter sera utilisé pour la perfusion intraveineuse des médicaments à l'étude (L-NMMA, kétorolac et acide ascorbique). Le deuxième cathéter sera utilisé pour prélever des échantillons de sang intermittents à 8 moments spécifiques tout au long de chaque visite d'étude pour assurer l'efficacité pharmaceutique et examiner les variables sanguines physiologiques systémiques d'intérêt. Le cathéter utilisé pour les prélèvements sanguins sera maintenu breveté avec un goutte-à-goutte de solution saline à 0,9 %. Si un seul cathéter IV peut être placé ou si l'un échoue, l'étude se poursuivra à la fois avec une perfusion de médicament et des prélèvements sanguins effectués à partir d'un seul cathéter.

Infusion intraveineuse de L-NMMA La L-NMMA intraveineuse est le seul médicament non approuvé par la FDA qui sera utilisé, mais il est couramment utilisé dans le cadre de la recherche. L'infusion intraveineuse de L-NMMA sera utilisée pour inhiber l'enzyme NOS qui est responsable de la formation de NO. La L-NMMA est une poudre lyophilisée diluée avec une solution saline. Dans l'étude actuelle, la L-NMMA intraveineuse sera administrée via une dose de charge de 3 mg kg-1 sur 5 minutes (36 mg kg-1 h-1), suivie d'une dose d'entretien de 1 mg kg-1 h-1 pour le reste de l'étude. Considérant un individu typique de 75 kg, cela se traduira par une dose de charge de 225 mg et une dose d'entretien (~ 112 min) de 140 mg totalisant 365 mg de L-NMMA pendant toute la durée de l'étude, lorsque la L-NMMA est le premier médicament à l'étude perfusé (L -NMMA infusé pendant HX1, HX2, HX3 et HC2, HC3, HC4). Au cours de la visite où la L-NMMA est le deuxième médicament à l'étude perfusé (L-NMMA perfusé pendant HX2, HX3 et HC3, HC4), la dose totale sera inférieure car la perfusion d'entretien (~ 67 min) sera réduite de ~ 45 minutes totalisant 309 mg L-NMMA. La dose de charge de L-NMMA est équivalente à celle utilisée dans une étude antérieure portant sur la contribution de la NOS à la vasodilatation cérébrale hypoxique, tandis que la dose d'entretien et la quantité absolue de L-NMMA infusée seront inférieures à celles utilisées précédemment.

Infusion intraveineuse de kétorolac Le kétorolac intraveineux est un anti-inflammatoire non stéroïdien approuvé par la FDA utilisé pour le traitement de la douleur. Le kétorolac sera utilisé pour inhiber de manière non spécifique l'enzyme cyclooxygénase responsable de la formation des prostaglandines vasoactives (prostacycline, thromboxane). L'inhibition de la synthèse des prostaglandines pendant l'hypoxie permettra d'évaluer la contribution de ces prostaglandines vasoactives à la vasodilatation hypoxique. Les doses intraveineuses courantes de kétorolac sont des perfusions en bolus de 15 mg et 30 mg; cependant, le kétorolac sera dosé en fonction de la masse corporelle. Le kétorolac sera administré par voie intraveineuse via une dose de charge de 0,3 mg kg-1 sur 5 minutes (3,6 mg kg-1 h-1) avec une dose de charge minimale de 15 mg. Cela sera ensuite suivi d'une dose d'entretien de 0,03 mg kg-1 h-1 pour le reste de l'étude. En considérant un individu typique de 75 kg, cela entraînera une dose de charge de 22,5 mg et une dose d'entretien (~ 112 min) de 4,2 mg totalisant 26,7 mg de kétorolac pendant toute la durée de l'étude, lorsque le kétorolac est le premier médicament à l'étude perfusé (kétorolac perfusé pendant HX1, HX2, HX3 et HC2, HC3, HC4). Au cours de la visite où le kétorolac est le deuxième médicament à l'étude infusé (kétorolac infusé pendant HX2, HX3 et HC3, HC4), la dose totale sera inférieure car la perfusion d'entretien (~ 67 min) sera réduite d'environ 45 minutes pour un total de 25 mg de kétorolac. Il a été démontré que des doses similaires de kétorolac réduisent les prostanoïdes du corps entier et réduisent la douleur périopératoire. Les concentrations plasmatiques de kétorolac culminent dans les ~3 minutes suivant l'administration intraveineuse avec une demi-vie terminale de 5,6 heures.

Infusion intraveineuse d'acide ascorbique L'acide ascorbique intraveineux est approuvé par la FDA. L'acide ascorbique sera administré par voie intraveineuse pour réduire de manière aiguë les ROS. L'acide ascorbique sera administré via une dose de charge de 0,035 g kg de masse sans graisse-1 sur 5 minutes (0,42 g kg de masse sans graisse-1 h-1). Suivi d'une dose d'entretien de 0,060 g kg de masse sans graisse-1 h-1 pendant la durée restante de l'étude (~ 20 minutes) pour une suppression continue des espèces réactives de l'oxygène. Considérant un individu de 75 kg avec une masse tissulaire sans graisse d'environ 55 kg (sur la base de sujets jeunes et en bonne santé dans notre laboratoire), les sujets recevront environ 3,025 g d'acide ascorbique au cours d'une visite d'étude.

Dosages au plasma

~ 10 mL de sang seront prélevés lors de la visite de dépistage dans le cadre de l'éligibilité à l'étude. Des échantillons de sang de dépistage seront analysés pour la glycémie veineuse à jeun, la créatinine, le cholestérol total, le cholestérol HDL, le cholestérol LDL et les triglycérides. Des échantillons de sang veineux seront prélevés à 8 points dans le temps au cours du protocole d'étude via un cathéter veineux. Chaque prise de sang sera de 10 ml, totalisant 80 ml. Le sang sera centrifugé avec le plasma et le sérum prélevés et conservés à -80 °C. L'efficacité de l'inhibition de la COX sera déterminée par la mesure (EIA) des métabolites circulants de la COX, la 6-céto-prostaglandine F1α (comme marqueur stable de PGI2) et le thromboxane B2 (un marqueur stable de TXA2). L'efficacité de l'inhibition des ROS sera déterminée par les concentrations plasmatiques de vitamine C et les lipoprotéines de basse densité oxydées (oxLDL) servant de marqueur systémique du stress oxydatif. Il a été démontré que l'administration intraveineuse aiguë d'acide ascorbique diminue l'oxLDL chez les adultes en bonne santé. L'efficacité de l'inhibition du NOS sera déterminée par la somme des nitrites et des nitrates (NOx), qui est considérée comme un indice de la production de NO.