Impacto de la inhibición de NOS, COX y ROS en la regulación del flujo sanguíneo cerebral

Objetivos específicos:

1A. Determinar las contribuciones independientes de NOS y COX a la vasodilatación hipóxica e hipercápnica en la ACM de adultos jóvenes sanos.

1B. Determinar la contribución combinada de NOS y COX a la vasodilatación hipóxica e hipercápnica en la ACM de adultos jóvenes sanos.

1. C. Determinar la contribución combinada de NOS, COX y ROS a la vasodilatación hipóxica e hipercápnica en la ACM de adultos jóvenes sanos.
2. A. Determinar las contribuciones independientes de NOS y COX a la vasodilatación hipóxica e hipercápnica en la BA de adultos jóvenes sanos.

2B. Determinar la contribución combinada de NOS y COX a la vasodilatación hipóxica e hipercápnica en la BA de adultos jóvenes sanos.

2C. Determinar la contribución combinada de NOS, COX y ROS a la vasodilatación hipóxica e hipercápnica en la BA de adultos jóvenes sanos.

Evaluación inicial: un cuestionario de evaluación por teléfono determinará si los sujetos potenciales cumplen o no con los criterios preliminares de elegibilidad. Los sujetos potencialmente elegibles serán invitados a una evaluación adicional en persona. Los sujetos deberán acudir a la visita de selección en ayunas (excepto agua) durante un mínimo de 10 horas.

Los procedimientos de detección de laboratorio incluyen:

1. Consentimiento informado
2. Cuestionario de historial de salud
3. Cuestionario de actividad física
4. Prueba de embarazo en orina (solo mujeres)
5. Extracción de sangre venosa
6. Escaneo DEXA (absorciometría de rayos X de energía dual)

Diseño del estudio: los sujetos elegibles completarán 2 visitas de estudio para examinar las respuestas hipóxicas e hipercápnicas en cuatro condiciones: control, inhibición de NOS o inhibición de COX, inhibición de NOS y COX e inhibición de NOS, COX y ROS. Durante la visita 1, los sujetos recibirán L-NMMA (NG-Monometil-L-arginina; inhibición de NOS), ketorolaco (inhibición de COX) y luego ácido ascórbico (inhibición de ROS). Durante la visita 2, los sujetos recibirán ketorolaco, L-NMMA y luego ácido ascórbico. Las visitas del estudio se realizarán en un orden aleatorizado y equilibrado y todos los medicamentos se infundirán por vía intravenosa. La hipoxia provocará un SPO2 ~ 80% según lo determinado por oximetría de pulso y la hipercapnia aumentará el CO2 al final de la espiración (PETCO2) en ~ 10 mmHg desde el valor inicial. A lo largo de cada visita, se controlará la frecuencia cardíaca, la presión arterial, la saturación de oxígeno de la oximetría de pulso, los gases respiratorios, la ventilación y la velocidad del CBF de los sujetos. Después de la instrumentación y la recopilación de datos de referencia, los ensayos hipóxicos e hipercápnicos comenzarán con el registro de la velocidad de la arteria cerebral media (MCAv), la velocidad de la arteria basilar (BAv), respiratorias y cardiovasculares. Todos los ensayos estarán separados por 10 minutos de descanso tranquilo mientras se respira el aire de la habitación y no se aleatorizarán debido al orden y el momento de las infusiones de fármacos necesarios para explorar nuestros objetivos. Debido a la dificultad de sonar el BA, esto servirá como un objetivo exploratorio y no se considerará un resultado necesario para completar el estudio.

Métodos Experimentales y Plan de Intervención:

Ultrasonido Doppler transcraneal (TCD) MCAv se medirá a través de la ventana transtemporal mientras que BAv se medirá a través de la ventana transforaminal con sondas de ultrasonido Doppler transcraneal de 2 MHz (megahercios). En aproximadamente el 30% de los individuos no se puede identificar el BA; por lo tanto, la sonorización de la MCA por sí sola se considerará suficiente para proceder con el estudio en los casos en los que no se pueda localizar BA.

Medidas Se medirá la altura y el peso para calcular el índice de masa corporal (IMC). Las circunferencias de cintura y cadera se medirán como indicadores de adiposidad regional. La exploración DEXA se utilizará para determinar la composición corporal. Se obtendrán muestras de sangre venosa para la determinación de los valores de química sanguínea. Durante cada visita, los sujetos serán estudiados en una posición semi-recostada e instrumentados para la medición continua de la frecuencia cardíaca (ECG de 3 derivaciones), saturación de oxígeno de oximetría de pulso (SPO2, oxímetro de pulso) y presión arterial (MABP, monitor fisiológico automatizado) . Los parámetros hemodinámicos se medirán continuamente con pletismografía digital. Los gases inspiratorios y espiratorios se medirán con un analizador de gases y el flujo respiratorio se determinará con un neumotacómetro calentado.

Hipoxia La hipoxia se utilizará para causar vasodilatación cerebral en condiciones de reposo semirrecostadas. Se realizarán tres ensayos de hipoxia isocápnica por visita de estudio. Los sujetos inspirarán a través de una válvula de no reinhalación de dos vías, conectada a un mezclador de gas, suministrado por oxígeno (O2) presurizado de grado médico, dióxido de carbono (CO2) y nitrógeno (N2). Después de 3 minutos de respiración con aire ambiental de referencia, se introducirá hipoxia al disminuir el O2 inspirado (~11 % de O2) para provocar y mantener 3 minutos de SPO2~80 % según lo determine un oxímetro de pulso. Después de 3 minutos de hipoxia en estado estacionario inicial, habrá un período de carga de fármaco de 5 minutos (L-NMMA, ketoroloc o ácido ascórbico), seguido de un período de mantenimiento del fármaco de 5 minutos. La hipoxia se mantendrá durante este tiempo, con una duración total de la hipoxia de ~15 minutos por cada prueba de hipoxia. La isocapnia se logrará mediante la adición de CO2 al gas inspirado. Se ha demostrado que el CO2 al final de la espiración (PETCO2) es un predictor válido de los niveles de CO2 en sangre arterial. Los datos anteriores de nuestro laboratorio indican que la hipoxia en estado estacionario se logra en 3 minutos. Además, se examinará la hipoxia que provoca una SPO2 ~ 80 %, ya que los vasos cerebrales tienen una sensibilidad cerebrovascular relativamente baja a una hipoxia menos grave (SPO2 ~ 90 %). Se realizará un total de 3 ensayos de hipoxia por visita de estudio, lo que producirá ~45 minutos de hipoxia en estado estacionario.

Hipercapnia Un aumento en el CO2 sistémico es una poderosa señal para aumentar el flujo sanguíneo dentro de la circulación cerebral. Se realizará un total de 4 pruebas hipercápnicas durante cada visita del estudio. Los sujetos inspirarán a través de una válvula de reinhalación deslizante de tres vías unida a un globo de látex que contiene una mezcla de gas hiperóxico (O2=40 %), hipercápnico (CO2=3 %) con el resto N2. El globo se llenará hasta un volumen que supere la capacidad vital estimada (determinada por la edad, el sexo y la altura) en 1 litro. Después de 3 minutos de respiración con aire ambiental de referencia, comenzará la hipercapnia al deslizar la válvula de reinhalación de tres vías desde el aire ambiental hasta el globo de látex adjunto. Durante la hipercapnia, la PETCO2 aumenta (~10 mmHg por encima de los valores iniciales), pero el O2 inspirado no cae por debajo del porcentaje de aire ambiente del 21 %. La hipercapnia se mantendrá (~2 minutos) hasta que los valores de PETCO2 alcancen ~10 mmHg por encima de los valores de referencia, después de lo cual el sujeto comenzará a respirar aire ambiente. La PETCO2 se utilizará como una medida fiable y no invasiva del CO2 arterial. Se realizará un total de 4 pruebas de hipercapnia por visita del estudio, lo que producirá ~ 8 minutos de hipercapnia por visita del estudio.

Catéter intravenoso El personal de laboratorio capacitado colocará dos catéteres intravenosos (uno en cada brazo) para cada visita del estudio. Se utilizará un catéter para la infusión intravenosa de los fármacos del estudio (L-NMMA, ketorolaco y ácido ascórbico). El segundo catéter se utilizará para extraer muestras de sangre intermitentes en 8 puntos de tiempo específicos durante cada visita del estudio para garantizar la eficacia farmacéutica y examinar las variables sanguíneas fisiológicas sistémicas de interés. El catéter utilizado para las extracciones de sangre se mantendrá permeable con un goteo de solución salina al 0,9%. Si solo se puede colocar un catéter intravenoso o uno falla, el estudio continuará con la infusión de medicamentos y la extracción de sangre desde un solo catéter.

Infusión intravenosa de L-NMMA La L-NMMA intravenosa es el único fármaco no aprobado por la FDA que se utilizará, pero se utiliza comúnmente en el ámbito de la investigación. Se usará una infusión intravenosa de L-NMMA para inhibir la enzima NOS que es responsable de la formación de NO. L-NMMA es un polvo liofilizado que se diluye con solución salina. En el estudio actual, se administrará L-NMMA por vía intravenosa mediante una dosis de carga de 3 mg kg-1 durante 5 minutos (36 mg kg-1 h-1), seguida de una dosis de mantenimiento de 1 mg kg-1 h-1 para el resto del estudio. Considerando un individuo típico de 75 kg, esto resultará en una dosis de carga de 225 mg y una dosis de mantenimiento (~112 min) de 140 mg, con un total de 365 mg de L-NMMA a lo largo de la duración del estudio, cuando L-NMMA es el primer fármaco del estudio infundido (L -NMMA infundido durante HX1, HX2, HX3 y HC2, HC3, HC4). Durante la visita, cuando L-NMMA es la segunda infusión del fármaco del estudio (L-NMMA infundida durante HX2, HX3 y HC3, HC4), la dosificación total será menor ya que la infusión de mantenimiento (~67 min) se reducirá en ~45 minutos por un total de 309 mg de L-NMMA. La dosis de carga de L-NMMA es equivalente a la utilizada en un estudio anterior que investigó la contribución de NOS a la vasodilatación cerebral hipóxica, mientras que la dosis de mantenimiento y la cantidad absoluta de L-NMMA infundida serán menores que las utilizadas anteriormente.

Infusión intravenosa de ketorolaco El ketorolaco intravenoso es un fármaco antiinflamatorio no esteroideo aprobado por la FDA que se utiliza para el tratamiento del dolor. El ketorolaco se utilizará para inhibir de forma no específica la enzima ciclooxigenasa responsable de la formación de prostaglandinas vasoactivas (prostaciclina, tromboxano). La inhibición de la síntesis de prostaglandinas durante la hipoxia permitirá evaluar la contribución de estas prostaglandinas vasoactivas a la vasodilatación hipóxica. Las dosis intravenosas comunes de ketorolaco son infusiones en bolo de 15 mg y 30 mg; sin embargo, el ketorolaco se dosificará en relación con la masa corporal. El ketorolaco se administrará por vía intravenosa a través de una dosis de carga de 0,3 mg kg-1 durante 5 minutos (3,6 mg kg-1 hr-1) con una dosis de carga mínima de 15 mg. A esto le seguirá una dosis de mantenimiento de 0,03 mg kg-1 h-1 durante el resto del estudio. Considerando un individuo típico de 75 kg, esto dará como resultado una dosis de carga de 22,5 mg y una dosis de mantenimiento (~112 min) de 4,2 mg, con un total de 26,7 mg de ketorolaco durante la duración del estudio, cuando el ketorolaco es el primer fármaco del estudio infundido (ketorolaco infundido durante HX1, HX2, HX3 y HC2, HC3, HC4). Durante la visita, cuando el ketorolaco es la segunda infusión del fármaco del estudio (ketorolaco infundido durante HX2, HX3 y HC3, HC4), la dosificación total será menor ya que la infusión de mantenimiento (~67 min) se reducirá en ~45 minutos, con un total de 25 mg de ketorolaco. Se ha demostrado que dosis similares de ketorolaco reducen los prostanoides de todo el cuerpo y reducen el dolor perioperatorio. Las concentraciones plasmáticas de ketorolaco alcanzan su punto máximo dentro de ~3 minutos después de la administración intravenosa con una vida media terminal de 5,6 horas.

Infusión de ácido ascórbico intravenoso El ácido ascórbico intravenoso está aprobado por la FDA. El ácido ascórbico se administrará por vía intravenosa para reducir de forma aguda las ROS. El ácido ascórbico se administrará mediante una dosis de carga de 0,035 g kg masa magra-1 durante 5 minutos (0,42 g kg masa magra-1 h-1). Seguido de una dosis de mantenimiento de 0,060 g kg masa libre de grasa-1 hr-1 durante el curso de tiempo restante del estudio (~20 minutos) para la supresión continua de especies reactivas de oxígeno. Considerando un individuo de 75 kg con una masa de tejido libre de grasa de ~55 kg (basado en sujetos anteriores jóvenes y sanos en nuestro laboratorio), los sujetos recibirán ~ 3,025 g de ácido ascórbico durante el transcurso de una visita de estudio.

Ensayos de plasma

Se extraerán ~10 ml de sangre durante la visita de selección como parte de la elegibilidad del estudio. Las muestras de sangre de detección se analizarán para glucosa venosa en ayunas, creatinina, colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL y triglicéridos. Se extraerán muestras de sangre venosa en 8 puntos temporales durante el protocolo del estudio a través de un catéter venoso. Cada extracción de sangre será de 10 mL, totalizando 80 mL. La sangre se centrifugará con extracción de plasma y suero y se almacenará a -80ºC. La eficacia de la inhibición de la COX se determinará mediante la medición (EIA) de los metabolitos circulantes de la COX 6-ceto-prostaglandina F1α (como marcador estable de PGI2) y tromboxano B2 (un marcador estable de TXA2). La eficacia de la inhibición de ROS estará determinada por las concentraciones plasmáticas de vitamina C y las lipoproteínas de baja densidad oxidadas (oxLDL) que sirven como marcador sistémico del estrés oxidativo. Se ha demostrado que la administración aguda de ácido ascórbico por vía intravenosa reduce el LDLox en adultos sanos. La eficacia de la inhibición de NOS estará determinada por la suma de nitrito y nitrato (NOx), que se considera un índice de producción de NO.