Wpływ hamowania NOS, COX i ROS na regulację przepływu krwi w mózgu

Cele szczegółowe:

1A. Określ niezależny udział NOS i COX w niedotlenieniu i hiperkapnii w rozszerzaniu naczyń w MCA młodych, zdrowych dorosłych.

1B. Określ łączny udział NOS i COX w niedotlenieniu i hiperkapnii w rozszerzaniu naczyń w MCA młodych, zdrowych dorosłych.

1. C. Określ łączny udział NOS, COX i ROS w niedotlenionym i hiperkapnicznym rozszerzeniu naczyń w MCA młodych, zdrowych dorosłych.
2. A. Określ niezależny wkład NOS i COX w niedotlenienie i hiperkapnię w BA u młodych, zdrowych dorosłych.

2B. Określ łączny udział NOS i COX w niedotlenieniu i hiperkapnii w rozszerzaniu naczyń w BA młodych, zdrowych dorosłych.

2C. Określ łączny udział NOS, COX i ROS w niedotlenionym i hiperkapnicznym rozszerzeniu naczyń w BA młodych, zdrowych dorosłych.

Wstępne badanie przesiewowe: Telefoniczny kwestionariusz przesiewowy określi, czy potencjalni uczestnicy spełniają wstępne kryteria kwalifikacyjne. Potencjalnie kwalifikujące się osoby zostaną zaproszone na dodatkowe osobiste badanie przesiewowe. Pacjenci będą musieli przyjść na wizytę przesiewową po poście (z wyjątkiem wody) przez co najmniej 10 godzin.

Laboratoryjne procedury przesiewowe obejmują:

1. Świadoma zgoda
2. Kwestionariusz historii zdrowia
3. Kwestionariusz aktywności fizycznej
4. Test ciążowy z moczu (tylko kobiety)
5. Pobranie krwi żylnej
6. Skan DEXA (absorpcjometria rentgenowska o podwójnej energii)

Projekt badania: Kwalifikujący się uczestnicy przejdą 2 wizyty badawcze badające reakcje hipoksji i hiperkapnii w czterech warunkach: kontrola, hamowanie NOS lub COX, hamowanie NOS i COX oraz hamowanie NOS, COX i ROS. Podczas wizyty 1 pacjenci otrzymają L-NMMA (NG-Monometylo-L-arginina; hamowanie NOS), ketorolak (hamowanie COX), następnie kwas askorbinowy (hamowanie ROS). Podczas drugiej wizyty badani otrzymają ketorolak, L-NMMA, następnie kwas askorbinowy. Wizyty studyjne będą odbywać się w losowej, zbilansowanej kolejności, a wszystkie leki będą podawane we wlewie dożylnym. Niedotlenienie wywoła SPO2 ~80%, jak określono za pomocą pulsoksymetrii, a hiperkapnia zwiększy końcowo-wydechowe CO2 (PETCO2) o ~10 mmHg od wartości początkowej. Podczas każdej wizyty pacjenci będą monitorowani pod kątem częstości akcji serca, ciśnienia krwi, nasycenia tlenem pulsoksymetrii, gazów oddechowych, wentylacji i prędkości CBF. Po zebraniu oprzyrządowania i danych wyjściowych rozpoczną się próby niedotlenienia i hiperkapnii z rejestracją prędkości tętnicy środkowej mózgu (MCAv), prędkości tętnicy podstawnej (BAv), parametrów oddechowych i sercowo-naczyniowych. Wszystkie próby będą oddzielone 10-minutowym spokojnym odpoczynkiem podczas oddychania powietrzem pokojowym i nie będą losowe ze względu na kolejność i czas wlewów leków wymaganych do zbadania naszych celów. Ze względu na trudność w naświetlaniu BA będzie to służyć jako cel eksploracyjny i nie będzie uważane za wynik konieczny do ukończenia badania.

Metody eksperymentalne i plan interwencji:

Przezczaszkowe badanie ultrasonograficzne dopplerowskie (TCD) MCAv będzie mierzone przez okno przezskroniowe, podczas gdy BAv będzie mierzone przez okienko przezforamilne za pomocą przezczaszkowych sond ultrasonograficznych dopplerowskich o częstotliwości 2 MHz (megaherców). U około 30% osób nie można zidentyfikować BA; dlatego samo naświetlanie MCA zostanie uznane za wystarczające do kontynuowania badania w przypadkach, w których nie można zlokalizować BA.

Pomiary Wzrost i waga zostaną zmierzone w celu obliczenia wskaźnika masy ciała (BMI). Obwody talii i bioder będą mierzone jako wskaźniki regionalnej otyłości. Do określenia składu ciała zostanie wykorzystany skan DEXA. Pobrane zostaną próbki krwi żylnej w celu określenia wartości biochemicznych krwi. Podczas każdej wizyty pacjenci będą badani w pozycji półleżącej i wyposażeni w przyrządy do ciągłego pomiaru częstości akcji serca (3-odprowadzeniowe EKG), pulsoksymetrii nasycenia tlenem (SPO2, pulsoksymetr) i ciśnienia krwi (MABP, automatyczny monitor fizjologiczny) . Parametry hemodynamiczne będą mierzone w sposób ciągły za pomocą pletyzmografii palcowej. Gazy wdechowe i wydechowe zostaną zmierzone za pomocą analizatora gazów, a przepływ oddechowy zostanie określony za pomocą podgrzewanego pneumotachometru.

Niedotlenienie Niedotlenienie będzie stosowane w celu wywołania rozszerzenia naczyń mózgowych w spoczynkowych, półleżących warunkach. Podczas jednej wizyty studyjnej zostaną przeprowadzone trzy próby niedotlenienia izokapnicznego. Badani będą inspirować się przez dwudrożny zawór bez ponownego oddychania, podłączony do mieszalnika gazów, dostarczanego przez sprężony tlen (O2), dwutlenek węgla (CO2) i azot (N2) klasy medycznej. Po 3 minutach podstawowego oddychania powietrzem pokojowym hipoksja zostanie wprowadzona poprzez zmniejszenie wdychanego O2 (~11% O2) w celu wywołania i utrzymania przez 3 minuty SPO2~80%, jak określono za pomocą pulsoksymetru. Po 3 minutach początkowego stanu stacjonarnego niedotlenienia nastąpi 5-minutowy okres nasycania lekiem (L-NMMA, ketorolok lub kwas askorbinowy), po którym nastąpi 5-minutowy okres podtrzymywania leku. Niedotlenienie będzie utrzymywane w tym czasie, a całkowity czas trwania niedotlenienia wynosi ~15 minut na każdą próbę niedotlenienia. Izokapnia zostanie osiągnięta poprzez dodanie CO2 do wdychanego gazu. Wykazano, że końcowo-wydechowe CO2 (PETCO2) jest ważnym predyktorem poziomów CO2 we krwi tętniczej. Wcześniejsze dane z naszego laboratorium wskazują, że stan stacjonarny hipoksji osiąga się w ciągu 3 minut. Dodatkowo zbadane zostanie niedotlenienie wywołujące SPO2 ~ 80%, ponieważ naczynia mózgowe mają stosunkowo niską wrażliwość naczyń mózgowych na mniej poważne niedotlenienie (SPO2 ~ 90%). Podczas jednej wizyty studyjnej zostaną przeprowadzone łącznie 3 próby hipoksji, co daje ~45 minut stanu stacjonarnego niedotlenienia.

Hiperkapnia Wzrost ogólnoustrojowego CO2 jest silnym sygnałem do zwiększenia przepływu krwi w krążeniu mózgowym. Podczas każdej wizyty studyjnej zostaną przeprowadzone łącznie 4 próby hiperkapnii. Badani będą wdychać przez trójdrożny przesuwny zawór oddechowy przymocowany do lateksowego balonu zawierającego hiperoksyczną (O2=40%), hiperkapniczną (CO2=3%) mieszaninę gazów z równowagą N2. Balon zostanie napełniony do objętości przekraczającej szacowaną pojemność życiową (określoną na podstawie wieku, płci i wzrostu) o 1 litr. Po 3 minutach podstawowego oddychania powietrzem pokojowym hiperkapnia rozpocznie się poprzez przesunięcie trójdrożnego zaworu oddechowego z powietrza pokojowego na przymocowany balon lateksowy. Podczas hiperkapni PETCO2 wzrasta (~10 mmHg powyżej wartości wyjściowych), ale wdychane O2 nie spada poniżej procentu powietrza w pomieszczeniu wynoszącego 21%. Hiperkapnia będzie utrzymywała się (~2 minuty), aż wartości PETCO2 osiągną ~10 mmHg powyżej wartości wyjściowych, po czym podmiot zacznie oddychać powietrzem pokojowym. PETCO2 będzie używany jako niezawodny, nieinwazyjny pomiar CO2 w krwi tętniczej. Podczas jednej wizyty studyjnej zostaną przeprowadzone łącznie 4 próby hiperkapnii, uzyskując ~ 8 minut hiperkapnii na wizytę studyjną.

Cewnik dożylny Przeszkolony personel laboratoryjny zakłada dwa cewniki dożylne (po jednym na każde ramię) podczas każdej wizyty badawczej. Jeden cewnik będzie używany do infuzji dożylnej badanych leków (L-NMMA, ketorolak i kwas askorbinowy). Drugi cewnik będzie używany do okresowego pobierania próbek krwi w 8 określonych punktach czasowych podczas każdej wizyty badawczej w celu zapewnienia skuteczności farmaceutycznej i zbadania systemowych fizjologicznych zmiennych krwi będących przedmiotem zainteresowania. Cewnik używany do pobierania krwi będzie chroniony patentem dzięki kroplówce z 0,9% roztworem soli fizjologicznej. Jeśli można umieścić tylko jeden cewnik dożylny lub jeden ulegnie awarii, badanie będzie kontynuowane zarówno z infuzją leku, jak i pobieraniem krwi z jednego cewnika.

Dożylna infuzja L-NMMA Dożylna L-NMMA jest jedynym lekiem niezatwierdzonym przez FDA, który będzie stosowany, ale jest powszechnie stosowany w warunkach badawczych. Dożylny wlew L-NMMA zostanie zastosowany do zahamowania enzymu NOS odpowiedzialnego za powstawanie NO. L-NMMA to liofilizowany proszek rozcieńczany solą fizjologiczną. W obecnym badaniu dożylny L-NMMA będzie podawany w dawce nasycającej 3 mg kg-1 w ciągu 5 minut (36 mg kg-1 godz.-1), a następnie w dawce podtrzymującej 1 mg kg-1 godz.-1 na pozostałą część studiów. Biorąc pod uwagę typową osobę o masie ciała 75 kg, da to dawkę nasycającą 225 mg i dawkę podtrzymującą (~112 min) 140 mg, co daje w sumie 365 mg L-NMMA przez cały czas trwania badania, kiedy to L-NMMA jest pierwszym badanym lekiem podanym we wlewie (L -NMMA podany podczas HX1, HX2, HX3 i HC2, HC3, HC4). Podczas wizyty, kiedy L-NMMA jest podawany jako drugi badany lek (L-NMMA podany podczas HX2, HX3 i HC3, HC4), całkowita dawka będzie mniejsza, ponieważ infuzja podtrzymująca (~67 min) zostanie zmniejszona o ~45 minut, łącznie 309 mg L-NMMA. Dawka nasycająca L-NMMA jest równoważna tej zastosowanej we wcześniejszym badaniu badającym udział NOS w niedotlenieniu rozszerzenia naczyń mózgowych, podczas gdy dawka podtrzymująca i bezwzględna ilość podawanego we wlewie L-NMMA będą mniejsze niż wcześniej stosowane.

Dożylny wlew ketorolakowy Dożylny ketorolak jest zatwierdzonym przez FDA niesteroidowym lekiem przeciwzapalnym stosowanym w leczeniu bólu. Ketorolak będzie stosowany do nieswoistego hamowania enzymu cyklooksygenazy odpowiedzialnego za tworzenie wazoaktywnych prostaglandyn (prostacyklina, tromboksan). Zahamowanie syntezy prostaglandyn podczas niedotlenienia pozwoli na ocenę udziału tych wazoaktywnych prostaglandyn w rozszerzeniu naczyń spowodowanym niedotlenieniem. Typowe dawki dożylne ketorolaku to 15 mg i 30 mg w bolusie; jednak ketorolak będzie dawkowany w stosunku do masy ciała. Ketorolak będzie podawany dożylnie w dawce nasycającej 0,3 mg kg-1 w ciągu 5 minut (3,6 mg kg-1 godz.-1) z minimalną dawką nasycającą 15 mg. Następnie przez pozostałą część badania zostanie podana dawka podtrzymująca 0,03 mg kg-1 godz.-1. Biorąc pod uwagę typową osobę o wadze 75 kg, da to dawkę nasycającą 22,5 mg i dawkę podtrzymującą (~112 min) wynoszącą 4,2 mg, co daje w sumie 26,7 mg ketorolaku przez cały czas trwania badania, kiedy ketorolak jest pierwszym badanym lekiem podanym we wlewie (ketorolak podany we wlewie podczas HX1, HX2, HX3 i HC2, HC3, HC4). Podczas wizyty, gdy ketorolak jest drugim badanym lekiem podawanym we wlewie ketorolak podczas HX2, HX3 i HC3, HC4) całkowita dawka będzie mniejsza, ponieważ infuzja podtrzymująca (~67 min) zostanie zmniejszona o ~45 minut, co daje łącznie 25 mg ketorolaku. Wykazano, że podobne dawki ketorolaku zmniejszają stężenie prostanoidów w całym organizmie i zmniejszają ból okołooperacyjny. Maksymalne stężenie ketorolaku w osoczu występuje w ciągu ~3 minut po podaniu dożylnym, a końcowy okres półtrwania wynosi 5,6 godziny.

Dożylny wlew kwasu askorbinowego Dożylny kwas askorbinowy jest zatwierdzony przez FDA. Kwas askorbinowy będzie podawany dożylnie w celu ostrej redukcji ROS. Kwas askorbinowy zostanie podany w dawce nasycającej 0,035 g kg beztłuszczowej masy-1 w ciągu 5 minut (0,42 g kg beztłuszczowej masy-1 godz.-1). Następnie podawano dawkę podtrzymującą 0,060 g kg beztłuszczowej masy-1 godz.-1 przez pozostały czas badania (~20 minut) w celu dalszego tłumienia reaktywnych form tlenu. Biorąc pod uwagę osobę o wadze 75 kg i masie tkanki beztłuszczowej ~ 55 kg (w oparciu o wcześniejsze młode, zdrowe osoby w naszym laboratorium), osoby otrzymają ~ 3,025 g kwasu askorbinowego podczas wizyty studyjnej.

Testy osocza

Około 10 ml krwi zostanie pobrane podczas wizyty przesiewowej jako składnik kwalifikacji do badania. Przesiewowe próbki krwi będą analizowane pod kątem glukozy żylnej na czczo, kreatyniny, cholesterolu całkowitego, cholesterolu HDL, cholesterolu LDL i trójglicerydów. Próbki krwi żylnej zostaną pobrane w 8 punktach czasowych podczas protokołu badania przez cewnik żylny. Każde pobranie krwi będzie wynosiło 10 ml, co daje w sumie 80 ml. Krew zostanie odwirowana z pobranym osoczem i surowicą i będzie przechowywana w temperaturze -80ºC. Skuteczność hamowania COX zostanie określona poprzez pomiar (EIA) krążących metabolitów COX 6-keto-prostaglandyny F1α (jako stabilny marker PGI2) i tromboksanu B2 (stabilny marker TXA2). Skuteczność hamowania ROS zostanie określona na podstawie stężenia witaminy C w osoczu oraz utlenionych lipoprotein o małej gęstości (oxLDL) służących jako ogólnoustrojowy marker stresu oksydacyjnego. Wykazano, że ostre dożylne podanie kwasu askorbinowego zmniejsza oxLDL u zdrowych osób dorosłych. Skuteczność hamowania NOS będzie określona przez sumę azotynów i azotanów (NOx), która jest uważana za wskaźnik produkcji NO.