Impacto da inibição de NOS, COX e ROS na regulação do fluxo sanguíneo cerebral

Objetivos Específicos:

1A. Determine as contribuições independentes de NOS e COX para a vasodilatação hipóxica e hipercápnica no MCA de adultos jovens e saudáveis.

1B. Determine a contribuição combinada de NOS e COX para a vasodilatação hipóxica e hipercápnica no MCA de adultos jovens e saudáveis.

1. C. Determinar a contribuição combinada de NOS, COX e ROS para a vasodilatação hipóxica e hipercápnica na MCA de adultos jovens e saudáveis.
2. A. Determinar as contribuições independentes de NOS e COX para a vasodilatação hipóxica e hipercápnica na AB de adultos jovens e saudáveis.

2B. Determine a contribuição combinada de NOS e COX para a vasodilatação hipóxica e hipercápnica na BA de adultos jovens e saudáveis.

2C. Determine a contribuição combinada de NOS, COX e ROS para a vasodilatação hipóxica e hipercápnica na BA de adultos jovens e saudáveis.

Triagem inicial: Um questionário de triagem por telefone determinará se os possíveis participantes atendem ou não aos critérios preliminares de elegibilidade. Sujeitos potencialmente elegíveis serão convidados para uma triagem pessoal adicional. Os indivíduos deverão comparecer à consulta de triagem em jejum (exceto água) por no mínimo 10 horas.

Os procedimentos de triagem de laboratório incluem:

1. Consentimento informado
2. Questionário de histórico de saúde
3. questionário de atividade física
4. Teste de gravidez de urina (somente mulheres)
5. Coleta de sangue venoso
6. Varredura DEXA (absorciometria de raios X de dupla energia)

Desenho do estudo: Os indivíduos elegíveis completarão 2 visitas de estudo examinando as respostas hipóxicas e hipercápnicas sob quatro condições: controle, inibição de NOS ou inibição de COX, inibição de NOS e COX e inibição de NOS, COX e ROS. Durante a visita 1, os indivíduos receberão L-NMMA (NG-Monometil-L-arginina; inibição de NOS), cetorolaco (inibição de COX) e, em seguida, ácido ascórbico (inibição de ROS). Durante a visita 2, os indivíduos receberão cetorolaco, L-NMMA e, em seguida, ácido ascórbico. As visitas do estudo serão conduzidas em ordem aleatória e balanceada e todos os medicamentos serão infundidos por via intravenosa. A hipóxia provocará um SPO2~80% conforme determinado pela oximetria de pulso e a hipercapnia aumentará o CO2 expirado (PETCO2) em ~10 mmHg a partir da linha de base. Ao longo de cada visita, os indivíduos serão monitorados quanto à frequência cardíaca, pressão arterial, oximetria de pulso, saturação de oxigênio, gases respiratórios, ventilação e velocidade CBF. Após a coleta de instrumentação e linha de base, os testes hipóxicos e hipercápnicos começarão com a velocidade da artéria cerebral média (MCAv), velocidade da artéria basilar (BAv), variáveis ​​respiratórias e cardiovasculares sendo registradas. Todos os ensaios serão separados por 10 minutos de descanso tranquilo enquanto se respira ar ambiente e não serão randomizados devido à ordem e ao tempo das infusões de drogas necessárias para explorar nossos objetivos. Devido à dificuldade de insonação do BA, esta servirá como objetivo exploratório e não será considerada um resultado necessário para a conclusão do estudo.

Métodos Experimentais e Plano de Intervenção:

Ultrassom Doppler transcraniano (TCD) O MCAv será medido através da janela transtemporal, enquanto o BAv será medido através da janela transforaminal com sondas de ultrassom Doppler transcraniano de 2 MHz (megahertz). Em aproximadamente 30% dos indivíduos a AB não pode ser identificada; portanto, apenas a insonação do MCA será considerada suficiente para prosseguir com o estudo nos casos em que o BA não pode ser localizado.

Medições Altura e peso serão medidos para calcular o índice de massa corporal (IMC). As circunferências da cintura e do quadril serão medidas como indicadores de adiposidade regional. A varredura DEXA será usada para determinação da composição corporal. Amostras de sangue venoso serão obtidas para determinação dos valores da química sanguínea. Durante cada visita, os indivíduos serão estudados em posição semi-reclinada e instrumentados para medição contínua da frequência cardíaca (ECG de 3 derivações), oximetria de pulso, saturação de oxigênio (SPO2, oxímetro de pulso) e pressão arterial (PAM, monitor fisiológico automatizado) . Os parâmetros hemodinâmicos serão medidos continuamente com pletismografia digital. Os gases inspiratórios e expiratórios serão medidos com um analisador de gases e o fluxo respiratório será determinado com um pneumotacômetro aquecido.

Hipóxia A hipóxia será usada para causar vasodilatação cerebral em repouso, condições semi-reclinadas. Três testes de hipóxia isocápnica serão realizados por visita de estudo. Os indivíduos inspirarão por meio de uma válvula antirrespiração bidirecional, conectada a um misturador de gás, fornecida por oxigênio pressurizado de grau médico (O2), dióxido de carbono (CO2) e nitrogênio (N2). Após 3 minutos de respiração de ar ambiente de linha de base, a hipóxia será introduzida diminuindo o O2 inspirado (~11% O2) para provocar e sustentar 3 minutos de SPO2~80% conforme determinado por um oxímetro de pulso. Após 3 minutos de hipóxia de estado estacionário de linha de base, haverá um período de carga de droga de 5 minutos (L-NMMA, cetoroloc ou ácido ascórbico), seguido por um período de manutenção de droga de 5 minutos. A hipóxia será mantida durante esse período, com duração total da hipóxia de aproximadamente 15 minutos por cada tentativa de hipóxia. A isocapnia será alcançada através da adição de CO2 ao gás inspirado. O CO2 expirado final (PETCO2) demonstrou ser um preditor válido dos níveis de CO2 no sangue arterial. Dados anteriores de nosso laboratório indicam que a hipóxia em estado estacionário é alcançada em 3 minutos. Além disso, a hipóxia que provoca um SPO2 ~ 80% será examinada, pois os vasos cerebrais têm sensibilidade cerebrovascular relativamente baixa para hipóxia menos grave (SPO2 ~ 90%). Um total de 3 ensaios de hipóxia será conduzido por visita de estudo, resultando em aproximadamente 45 minutos de hipóxia em estado estacionário.

Hipercapnia Um aumento no CO2 sistêmico é um sinal poderoso para aumentar o fluxo sanguíneo dentro da circulação cerebral. Um total de 4 ensaios hipercápnicos serão realizados durante cada visita do estudo. Os indivíduos inspirarão através de uma válvula de reinalação deslizante de três vias conectada a um balão de látex contendo uma mistura de gás hiperóxico (O2 = 40%), hipercápnico (CO2 = 3%) com o equilíbrio N2. O balão será preenchido até um volume superior à capacidade vital estimada (conforme determinado por idade, sexo e altura) em 1 litro. Após 3 minutos de respiração de ar ambiente de linha de base, a hipercapnia começará deslizando a válvula de reinalação de três vias do ar ambiente para o balão de látex conectado. Durante a hipercapnia, o PETCO2 aumenta (~10 mmHg acima dos valores basais), mas o O2 inspirado não cai abaixo da porcentagem de ar ambiente de 21%. A hipercapnia será sustentada (~ 2 minutos) até que os valores de PETCO2 atinjam ~ 10 mmHg acima dos valores basais, após o que o indivíduo começará a respirar o ar ambiente. O PETCO2 será usado como uma medida confiável e não invasiva do CO2 arterial. Um total de 4 testes de hipercapnia será conduzido por visita de estudo, resultando em aproximadamente 8 minutos de hipercapnia por visita de estudo.

Cateter Intravenoso Pessoal de laboratório treinado colocará dois cateteres intravenosos (um em cada braço) para cada visita do estudo. Um cateter será usado para a infusão intravenosa dos medicamentos do estudo (L-NMMA, cetorolaco e ácido ascórbico). O segundo cateter será usado para coletar amostras de sangue intermitentes em 8 pontos de tempo específicos ao longo de cada visita do estudo para garantir a eficácia farmacêutica e examinar as variáveis ​​sanguíneas fisiológicas sistêmicas de interesse. O cateter usado para coleta de sangue será mantido patente com soro fisiológico 0,9%. Se apenas um cateter IV puder ser colocado ou um falhar, o estudo prosseguirá com a infusão de drogas e coletas de sangue ocorrendo de um único cateter.

Infusão intravenosa de L-NMMA L-NMMA intravenoso é o único medicamento não aprovado pela FDA que será usado, mas é comumente utilizado no ambiente de pesquisa. A infusão intravenosa de L-NMMA será utilizada para inibir a enzima NOS, responsável pela formação de NO. L-NMMA é um pó liofilizado que é diluído com solução salina. No estudo atual, L-NMMA intravenoso será administrado por meio de uma dose de ataque de 3 mg kg-1 durante 5 minutos (36 mg kg-1 h-1), seguido por uma dose de manutenção de 1 mg kg-1 h-1 para o restante do estudo. Considerando um indivíduo típico de 75 kg, isso resultará em uma dose de ataque de 225 mg e uma dose de manutenção (~112 min) de 140 mg, totalizando 365 mg de L-NMMA ao longo da duração do estudo, quando L-NMMA é o primeiro medicamento do estudo infundido (L -NMMA infundido durante HX1, HX2, HX3 e HC2, HC3, HC4). Durante a visita, quando L-NMMA é a segunda infusão do medicamento do estudo (L-NMMA infundido durante HX2, HX3 e HC3, HC4), a dosagem total será menor, pois a infusão de manutenção (~67 min) será reduzida em ~45 minutos, totalizando 309 mg de L-NMMA. A dose de ataque de L-NMMA é equivalente àquela usada em um estudo anterior que investigou a contribuição de NOS para a vasodilatação cerebral hipóxica, enquanto a dose de manutenção e a quantidade absoluta de L-NMMA infundida serão menores do que as utilizadas anteriormente.

Infusão intravenosa de cetorolaco O cetorolaco intravenoso é um fármaco anti-inflamatório não esteróide aprovado pela FDA usado para o tratamento da dor. O cetorolaco será utilizado para inibir inespecificamente a enzima ciclooxigenase responsável pela formação de prostaglandinas vasoativas (prostaciclina, tromboxano). A inibição da síntese de prostaglandinas durante a hipóxia permitirá a avaliação da contribuição dessas prostaglandinas vasoativas para a vasodilatação hipóxica. Doses intravenosas comuns de cetorolaco são infusões em bolus de 15 mg e 30 mg; no entanto, o cetorolaco será dosado em relação à massa corporal. O cetorolaco será administrado por via intravenosa através de uma dose de ataque de 0,3 mg kg-1 durante 5 minutos (3,6 mg kg-1 h-1) com uma dose de ataque mínima de 15 mg. Isso será seguido por uma dose de manutenção de 0,03 mg kg-1 h-1 para o restante do estudo. Considerando um indivíduo típico de 75 kg, isso resultará em uma dose de ataque de 22,5 mg e uma dose de manutenção (~112min) de 4,2 mg, totalizando 26,7 mg de cetorolaco durante todo o estudo, quando o cetorolaco é o primeiro medicamento do estudo infundido (cetorolaco infundido durante HX1, HX2, HX3 e HC2, HC3, HC4). Durante a visita, quando o cetorolaco é o segundo medicamento do estudo infundido (cetorolaco infundido durante HX2, HX3 e HC3, HC4), a dosagem total será menor, pois a infusão de manutenção (~67 min) será reduzida em ~45 minutos, totalizando 25 mg de cetorolac. Doses semelhantes de cetorolaco demonstraram reduzir os prostanóides de todo o corpo e reduzir a dor perioperatória. As concentrações plasmáticas de cetorolaco atingem o pico em aproximadamente 3 minutos após a administração intravenosa com uma meia-vida terminal de 5,6 horas.

Infusão intravenosa de ácido ascórbico O ácido ascórbico intravenoso é aprovado pela FDA. O ácido ascórbico será administrado por via intravenosa para reduzir agudamente ROS. O ácido ascórbico será administrado por meio de dose de ataque de 0,035 g kg de massa isenta de gordura-1 durante 5 minutos (0,42 g kg de massa isenta de gordura-1 h-1). Seguido por uma dose de manutenção de 0,060 g kg de massa isenta de gordura-1 h-1 durante o período restante do estudo (~ 20 minutos) para supressão contínua de espécies reativas de oxigênio. Considerando um indivíduo de 75 kg com uma massa de tecido livre de gordura de ~ 55 kg (com base em indivíduos jovens e saudáveis ​​anteriores em nosso laboratório), os indivíduos receberão ~ 3,025 g de ácido ascórbico durante uma visita de estudo.

Ensaios de Plasma

~10 mL de sangue serão coletados durante a visita de triagem como um componente de elegibilidade do estudo. Amostras de sangue de triagem serão analisadas para glicose venosa em jejum, creatinina, colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL e triglicerídeos. Amostras de sangue venoso serão coletadas em 8 pontos de tempo durante o protocolo de estudo por meio de um cateter venoso. Cada coleta de sangue será de 10 mL, totalizando 80 mL. O sangue será centrifugado com plasma e soro retirados e armazenados a -80ºC. A eficácia da inibição da COX será determinada pela dosagem (EIA) dos metabólitos circulantes da COX 6-ceto-prostaglandina F1α (como marcador estável de PGI2) e tromboxano B2 (marcador estável de TXA2). A eficácia da inibição de ROS será determinada pelas concentrações plasmáticas de vitamina C e lipoproteínas de baixa densidade oxidadas (oxLDL) servindo como um marcador sistêmico de estresse oxidativo. A administração intravenosa aguda de ácido ascórbico demonstrou diminuir oxLDL em adultos saudáveis. A eficácia da inibição de NOS será determinada pela soma de nitrito e nitrato (NOx), que é considerado um índice de produção de NO.