Inverkan av NOS-, COX- och ROS-hämning på cerebral blodflödesreglering

Specifika mål:

1A. Bestäm de oberoende bidragen från NOS och COX till hypoxisk och hyperkapnisk vasodilatation i MCA hos unga, friska vuxna.

IB. Bestäm det kombinerade bidraget av NOS och COX till hypoxisk och hyperkapnisk vasodilatation i MCA hos unga, friska vuxna.

1. C. Bestäm det kombinerade bidraget av NOS, COX och ROS till hypoxisk och hyperkapnisk vasodilatation i MCA hos unga, friska vuxna.
2. A. Bestäm de oberoende bidragen från NOS och COX till hypoxisk och hyperkapnisk vasodilatation i BA hos unga, friska vuxna.

2B. Bestäm det kombinerade bidraget av NOS och COX till hypoxisk och hyperkapnisk vasodilatation i BA hos unga, friska vuxna.

2C. Bestäm det kombinerade bidraget av NOS, COX och ROS till hypoxisk och hyperkapnisk vasodilatation i BA hos unga, friska vuxna.

Inledande granskning: Ett frågeformulär för telefonscreening kommer att avgöra om potentiella försökspersoner uppfyller de preliminära behörighetskriterierna. Potentiellt kvalificerade ämnen kommer att bjudas in för en ytterligare personlig screening. Försökspersonerna måste komma till screeningbesöket efter att ha fastat (förutom vatten) i minst 10 timmar.

Laboratorieundersökningar inkluderar:

1. Informerat samtycke
2. Hälsohistoria frågeformulär
3. Frågeformulär för fysisk aktivitet
4. Uringraviditetstest (endast kvinnor)
5. Drag av venöst blod
6. DEXA scan (dubbel energi röntgenabsorptiometri)

Studiedesign: Kvalificerade försökspersoner kommer att genomföra 2 studiebesök för att undersöka hypoxiska och hyperkapniska svar under fyra förhållanden: kontroll, NOS-hämning eller COX-hämning, NOS- och COX-hämning och NOS-, COX- och ROS-hämning. Under besök 1 kommer försökspersoner att få L-NMMA (NG-Monometyl-L-arginin; NOS-hämning), ketorolac (COX-hämning), sedan askorbinsyra (ROS-hämning). Under besök 2 kommer försökspersonerna att få ketorolak, L-NMMA och sedan askorbinsyra. Studiebesök kommer att genomföras i en randomiserad, balanserad ordning och alla läkemedel kommer att infunderas intravenöst. Hypoxi kommer att framkalla en SPO2~80% som bestäms av pulsoximetri och hyperkapni kommer att öka end-tidal CO2 (PETCO2) med ~10 mmHg från baslinjen. Under varje besök kommer försökspersoner att övervakas med avseende på hjärtfrekvens, blodtryck, pulsoximetrisyrgasmättnad, andningsgaser, ventilation och CBF-hastighet. Efter instrumentering och insamling av baslinjedata, kommer hypoxiska och hyperkapniska försök att påbörjas med mellanhjärnartärhastighet (MCAv), basilarartärhastighet (BAv), andnings- och kardiovaskulära variabler som registreras. Alla försök kommer att separeras av 10 minuters lugn vila medan du andas rumsluft och kommer inte att randomiseras på grund av ordningen och tidpunkten för läkemedelsinfusioner som krävs för att utforska våra mål. På grund av svårigheten att insonera BA, kommer detta att fungera som ett utforskande syfte och inte anses vara ett nödvändigt resultat för slutförande av studien.

Experimentella metoder och interventionsplan:

Transkraniellt Doppler Ultraljud (TCD) MCAv kommer att mätas via det transtemporala fönstret medan BAv kommer att mätas genom det transforaminala fönstret med 2 MHz (megahertz) transkraniell Doppler ultraljudssonder. Hos cirka 30 % av individerna kan BA inte identifieras; därför kommer enbart insonation av MCA att anses tillräckligt för att fortsätta med studien i fall där BA inte kan lokaliseras.

Mätningar Längd och vikt kommer att mätas för att beräkna kroppsmassaindex (BMI). Midje- och höftomkretsar kommer att mätas som indikatorer på regional fett. DEXA skanning kommer att användas för bestämning av kroppssammansättning. Venösa blodprov kommer att tas för bestämning av blodkemivärden. Under varje besök kommer försökspersoner att studeras i en halvt liggande position och instrumenteras för kontinuerlig mätning av hjärtfrekvens (3-avlednings-EKG), pulsoximetri syremättnad (SPO2, pulsoximeter) och blodtryck (MABP, automatiserad fysiologisk monitor) . Hemodynamiska parametrar kommer att mätas kontinuerligt med fingerpletysmografi. Inspirations- och utandningsgaser kommer att mätas med en gasanalysator och andningsflödet kommer att bestämmas med en uppvärmd pneumotachometer.

Hypoxi Hypoxi kommer att användas för att orsaka cerebral vasodilatation under vilande, halvt liggande förhållanden. Tre försök med isokapnisk hypoxi kommer att utföras per studiebesök. Försökspersoner kommer att inspirera genom en tvåvägs icke-återandningsventil, ansluten till en gasblandare, tillförd av medicinsk kvalitet trycksatt syre (O2), koldioxid (CO2) och kväve (N2). Efter 3 minuters baslinjeandning av rumsluft introduceras hypoxi genom att minska inandad O2 (~11% O2) för att framkalla och upprätthålla 3-minuters SPO2~80% som bestäms av en pulsoximeter. Efter 3 minuter av baseline steady state hypoxi kommer det att finnas en 5-minuters läkemedelsladdningsperiod (L-NMMA, ketoroloc eller askorbinsyra), följt av en 5-minuters läkemedelsunderhållsperiod. Hypoxi kommer att bibehållas under denna tid, med en total hypoxivaraktighet på ~15 minuter per varje hypoxiförsök. Isokapni kommer att uppnås genom tillsats av CO2 till inandad gas. End-tidal CO2 (PETCO2) har visat sig vara en giltig prediktor för CO2-nivåer i arteriell blod. Tidigare data från vårt labb indikerar att steady state hypoxi uppnås inom 3 minuter. Dessutom kommer hypoxi som framkallar en SPO2~80% att undersökas eftersom cerebrala kärl har relativt låg cerebrovaskulär känslighet för mindre allvarlig hypoxi (SPO2~90%). Totalt 3 hypoxiförsök kommer att genomföras per studiebesök vilket ger ~45 minuter av steady state-hypoxi.

Hyperkapni En ökning av systemisk CO2 är en kraftfull signal för att öka blodflödet i den cerebrala cirkulationen. Totalt 4 hyperkapniska prövningar kommer att utföras under varje studiebesök. Försökspersoner kommer att inspirera genom en trevägs glidande återandningsventil fäst vid en latexballong som innehåller en hyperoxisk (O2=40%), hyperkapnisk (CO2=3%) gasblandning med resten N2. Ballongen kommer att fyllas till en volym som överstiger den uppskattade vitala kapaciteten (bestämd av ålder, kön och höjd) med 1 liter. Efter 3 minuters baslinjeandning av rumsluft, kommer hyperkapni att börja genom att trevägsventilen för återandningsventilen skjuts från rumsluften till den anslutna latexballongen. Under hyperkapni ökar PETCO2 (~10 mmHg över baslinjevärdena), men inandad O2 faller inte under rumsluftprocenten på 21 %. Hyperkapni kommer att bibehållas (~2 minuter) tills PETCO2-värdena når ~10 mmHg över baslinjevärdena, varefter patienten börjar andas rumsluft. PETCO2 kommer att användas som ett pålitligt, icke-invasivt mått på arteriell CO2. Totalt 4 hyperkapniska prövningar kommer att genomföras per studiebesök vilket ger ~ 8 minuter av hyperkapni per studiebesök.

Intravenös kateter Utbildad labbpersonal kommer att placera två intravenösa katetrar (en i varje arm) för varje studiebesök. En kateter kommer att användas för intravenös infusion av studieläkemedel (L-NMMA, ketorolac och askorbinsyra). Den andra katetern kommer att användas för att ta intermittenta blodprover vid 8-specifika tidpunkter under varje studiebesök för att säkerställa farmaceutisk effekt och undersöka systemiska fysiologiska blodvariabler av intresse. Katetern som används för blodtagningar kommer att hållas patenterad med 0,9 % saltlösning. Om endast en IV-kateter kan placeras eller en misslyckas, kommer studien att fortsätta med både läkemedelsinfusion och blodtappningar från en enda kateter.

Intravenös L-NMMA-infusion Intravenös L-NMMA är det enda icke-FDA-godkända läkemedlet som kommer att användas, men används ofta i forskningsmiljön. Intravenös infusion av L-NMMA kommer att användas för att hämma enzymet NOS som är ansvarigt för bildandet av NO. L-NMMA är ett lyofiliserat pulver som späds ut med koksaltlösning. I den aktuella studien kommer intravenös L-NMMA att administreras via en laddningsdos på 3 mg kg-1 under 5 minuter (36 mg kg-1 timme-1), följt av en underhållsdos på 1 mg kg-1 timme-1 för resten av studien. Med tanke på en typisk 75 kg individ kommer detta att resultera i en laddningsdos på 225 mg och en underhållsdos (~112min) på 140 mg på totalt 365 mg L-NMMA under hela studiens varaktighet, när L-NMMA är det första studieläkemedlet som infunderas (L -NMMA infunderat under HX1, HX2, HX3 och HC2, HC3, HC4). Under besöket när L-NMMA är andra studieläkemedelsinfunderad (L-NMMA infunderad under HX2, HX3 och HC3, HC4) kommer den totala dosen att vara mindre eftersom underhållsinfusionen (~67 min) kommer att minskas med ~45 minuter till totalt 309 mg L-NMMA. Laddningsdosen av L-NMMA är ekvivalent med den som användes i en tidigare studie som undersökte bidraget från NOS till hypoxisk cerebral vasodilatation medan underhållsdosen och den absoluta mängden L-NMMA som infunderas kommer att vara mindre än vad som tidigare använts.

Intravenös ketorolacinfusion Intravenös ketorolac är FDA-godkända icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel som används för behandling av smärta. Ketorolac kommer att användas för att icke-specifikt hämma enzymet cyklooxygenas som är ansvarigt för bildandet av vasoaktiva prostaglandiner (prostacyklin, tromboxan). Hämning av prostaglandinsyntes under hypoxi kommer att möjliggöra bedömning av bidraget från dessa vasoaktiva prostaglandiner till hypoxisk vasodilatation. Vanliga intravenösa doser av ketorolak är 15 mg och 30 mg bolusinfusioner; dock kommer ketorolak att doseras i förhållande till kroppsmassan. Ketorolac kommer att administreras intravenöst via en laddningsdos på 0,3 mg kg-1 under 5 minuter (3,6 mg kg-1 timme-1) med en minsta laddningsdos på 15 mg. Detta kommer sedan att följas av en underhållsdos på 0,03 mg kg-1 timme-1 under resten av studien. Med tanke på en typisk 75 kg individ kommer detta att resultera i en laddningsdos på 22,5 mg och en underhållsdos (~112min) på 4,2 mg på totalt 26,7 mg ketorolak under hela studiens varaktighet, när ketorolak är det första studieläkemedlet som infunderas (ketorolak infunderas under studien). HX1, HX2, HX3 och HC2, HC3, HC4). Under besöket när ketorolac är den andra studieläkemedlet infunderad ketorolak infunderad under HX2, HX3 och HC3, HC4) kommer den totala dosen att vara mindre eftersom underhållsinfusionen (~67 min) kommer att minskas med ~45 minuter med totalt 25 mg ketorolak. Liknande doser av ketorolac har visat sig minska prostanoider i hela kroppen och minska perioperativ smärta. Koncentrationen av ketorolak i plasma når sin topp inom ~3 minuter efter intravenös administrering med en terminal halveringstid på 5,6 timmar.

Intravenös askorbinsyrainfusion Intravenös askorbinsyra är FDA-godkänd. Askorbinsyra kommer att administreras intravenöst för att akut minska ROS. Askorbinsyra kommer att administreras via laddningsdos på 0,035 g kg fettfri massa-1 under 5 minuter (0,42 g kg fettfri massa-1 timme-1). Följt av en underhållsdos på 0,060 g kg fettfri massa-1 timme-1 under den återstående studietiden (~20 minuter) för fortsatt undertryckande av reaktiva syreämnen. Med tanke på en individ på 75 kg med en fettfri vävnadsmassa på ~55 kg (baserat på tidigare unga, friska försökspersoner i vårt labb), kommer försökspersonerna att få ~3,025 g askorbinsyra under ett studiebesök.

Plasmaanalyser

~10 ml blod kommer att tas under screeningbesöket som en del av studieberättigande. Screening av blodprover kommer att analyseras för fastande venös glukos, kreatinin, totalt kolesterol, HDL-kolesterol, LDL-kolesterol och triglycerider. Venösa blodprover kommer att tas vid 8 tidpunkter under studieprotokollet via en venkateter. Varje blodprov kommer att vara 10 ml, totalt 80 ml. Blod kommer att centrifugeras med plasma och serum borttappad och förvaras vid -80ºC. Effekten av COX-hämning kommer att bestämmas genom mätning (EIA) av de cirkulerande COX-metaboliterna 6-keto-prostaglandin F1α (som stabil markör för PGI2) och tromboxan B2 (en stabil markör för TXA2). Effekten av ROS-hämning kommer att bestämmas av plasma-vitamin C-koncentrationer och oxiderade lågdensitetslipoproteiner (oxLDL) som fungerar som en systemisk markör för oxidativ stress. Akut intravenös administrering av askorbinsyra har visats minska oxLDL hos friska vuxna. Effekten av NOS-hämning kommer att bestämmas av summan av nitrit och nitrat (NOx), vilket anses vara ett index för NO-produktion.