Impatto dell'inibizione di NOS, COX e ROS sulla regolazione del flusso sanguigno cerebrale

Obiettivi specifici:

1A. Determinare i contributi indipendenti di NOS e COX alla vasodilatazione ipossica e ipercapnica nella MCA di adulti giovani e sani.

1B. Determinare il contributo combinato di NOS e COX alla vasodilatazione ipossica e ipercapnica nella MCA di adulti giovani e sani.

1. C. Determinare il contributo combinato di NOS, COX e ROS alla vasodilatazione ipossica e ipercapnica nella MCA di adulti giovani e sani.
2. A. Determinare i contributi indipendenti di NOS e COX alla vasodilatazione ipossica e ipercapnica nella BA di adulti giovani e sani.

2B. Determinare il contributo combinato di NOS e COX alla vasodilatazione ipossica e ipercapnica nella BA di adulti giovani e sani.

2C. Determinare il contributo combinato di NOS, COX e ROS alla vasodilatazione ipossica e ipercapnica nella BA di adulti giovani e sani.

Screening iniziale: un questionario di screening telefonico determinerà se i potenziali soggetti soddisfano o meno i criteri di ammissibilità preliminari. I soggetti potenzialmente idonei saranno invitati per un ulteriore screening di persona. I soggetti dovranno presentarsi alla visita di screening a digiuno (ad eccezione dell'acqua) per un minimo di 10 ore.

Le procedure di screening di laboratorio includono:

1. Consenso informato
2. Questionario sulla storia della salute
3. Questionario sull'attività fisica
4. Test di gravidanza sulle urine (solo donne)
5. Prelievo di sangue venoso
6. Scansione DEXA (assorbimetria a raggi X a doppia energia)

Disegno dello studio: i soggetti idonei completeranno 2 visite di studio esaminando le risposte ipossiche e ipercapniche in quattro condizioni: controllo, inibizione NOS o inibizione COX, inibizione NOS e COX e inibizione NOS, COX e ROS. Durante la visita 1, i soggetti riceveranno L-NMMA (NG-monometil-L-arginina; inibizione NOS), ketorolac (inibizione COX), quindi acido ascorbico (inibizione ROS). Durante la visita 2, i soggetti riceveranno ketorolac, L-NMMA, quindi acido ascorbico. Le visite di studio saranno condotte in un ordine randomizzato e controbilanciato e tutti i farmaci saranno infusi per via endovenosa. L'ipossia susciterà un SPO2 ~ 80% come determinato dalla pulsossimetria e l'ipercapnia aumenterà la CO2 di fine espirazione (PETCO2) di ~ 10 mmHg rispetto al basale. Durante ogni visita, i soggetti verranno monitorati per frequenza cardiaca, pressione sanguigna, pulsossimetria saturazione di ossigeno, gas respiratori, ventilazione e velocità CBF. Dopo la strumentazione e la raccolta dei dati di base, inizieranno le prove ipossiche e ipercapniche con la registrazione della velocità dell'arteria cerebrale media (MCAv), della velocità dell'arteria basilare (BAv), respiratoria e cardiovascolare. Tutte le prove saranno separate da 10 minuti di riposo tranquillo respirando aria ambiente e non saranno randomizzate a causa dell'ordine e dei tempi delle infusioni di farmaci necessarie per esplorare i nostri obiettivi. A causa della difficoltà di insononare il BA, questo servirà come scopo esplorativo e non sarà ritenuto un risultato necessario per il completamento dello studio.

Metodi sperimentali e piano di intervento:

L'ecografia transcranica Doppler (TCD) MCAv sarà misurata attraverso la finestra transtemporale mentre la BAv sarà misurata attraverso la finestra transforaminale con sonde ecografiche Doppler transcraniche da 2 MHz (megahertz). In circa il 30% degli individui la BA non può essere identificata; pertanto, l'insonazione del solo MCA sarà ritenuta sufficiente per procedere allo studio nei casi in cui BA non può essere localizzato.

Misure Altezza e peso saranno misurati per calcolare l'indice di massa corporea (BMI). Le circonferenze vita e fianchi saranno misurate come indicatori di adiposità regionale. La scansione DEXA verrà utilizzata per la determinazione della composizione corporea. Verranno prelevati campioni di sangue venoso per la determinazione dei valori ematochimici. Durante ogni visita, i soggetti saranno studiati in posizione semi-sdraiata e strumentati per la misurazione continua della frequenza cardiaca (ECG a 3 derivazioni), della pulsossimetria, della saturazione dell'ossigeno (SPO2, pulsossimetro) e della pressione sanguigna (MABP, monitor fisiologico automatizzato) . I parametri emodinamici saranno misurati in continuo con pletismografia delle dita. I gas inspiratori ed espiratori saranno misurati con un analizzatore di gas e il flusso respiratorio sarà determinato con un pneumotacografo riscaldato.

Ipossia L'ipossia verrà utilizzata per causare vasodilatazione cerebrale in condizioni di riposo, semi-sdraiate. Verranno eseguite tre prove di ipossia isocapnica per visita di studio. I soggetti inspireranno attraverso una valvola di non respirazione a due vie, collegata a un miscelatore di gas, fornito da ossigeno pressurizzato di grado medico (O2), anidride carbonica (CO2) e azoto (N2). Dopo 3 minuti di respirazione dell'aria ambiente di base, verrà introdotta l'ipossia diminuendo l'O2 inspirato (~ 11% O2) per suscitare e sostenere 3 minuti di SPO2 ~ 80% come determinato da un pulsossimetro. Dopo 3 minuti di ipossia allo stato stazionario al basale, ci sarà un periodo di carico del farmaco di 5 minuti (L-NMMA, ketoroloc o acido ascorbico), seguito da un periodo di mantenimento del farmaco di 5 minuti. L'ipossia verrà mantenuta durante questo periodo, con una durata totale dell'ipossia di ~ 15 minuti per ogni prova di ipossia. L'isocapnia sarà ottenuta attraverso l'aggiunta di CO2 al gas inspirato. La CO2 di fine espirazione (PETCO2) ha dimostrato di essere un valido predittore dei livelli di CO2 nel sangue arterioso. I dati precedenti del nostro laboratorio indicano che l'ipossia allo stato stazionario viene raggiunta entro 3 minuti. Inoltre, l'ipossia che provoca un SPO2 ~ 80% sarà esaminata poiché i vasi cerebrali hanno una sensibilità cerebrovascolare relativamente bassa all'ipossia meno grave (SPO2 ~ 90%). Verranno condotti un totale di 3 studi di ipossia per visita di studio ottenendo circa 45 minuti di ipossia allo stato stazionario.

Ipercapnia Un aumento della CO2 sistemica è un segnale potente per aumentare il flusso sanguigno all'interno della circolazione cerebrale. Durante ogni visita di studio verranno eseguiti un totale di 4 prove ipercapniche. I soggetti inspireranno attraverso una valvola di respirazione scorrevole a tre vie attaccata a un palloncino di lattice contenente una miscela di gas iperossico (O2=40%), ipercapnico (CO2=3%) con il saldo N2. Il pallone sarà riempito fino a un volume superiore alla capacità vitale stimata (determinata dall'età, dal sesso e dall'altezza) di 1 litro. Dopo 3 minuti di respirazione dell'aria della stanza di base, l'ipercapnia inizierà facendo scorrere la valvola di respirazione a tre vie dall'aria della stanza al palloncino in lattice attaccato. Durante l'ipercapnia, la PETCO2 aumenta (~10 mmHg al di sopra dei valori basali), ma l'O2 inspirato non scende al di sotto della percentuale di aria ambiente del 21%. L'ipercapnia sarà sostenuta (~ 2 minuti) fino a quando i valori di PETCO2 non raggiungeranno ~ 10 mmHg sopra i valori basali, dopodiché il soggetto inizierà a respirare aria ambiente. La PETCO2 sarà utilizzata come misura affidabile e non invasiva della CO2 arteriosa. Verranno condotti un totale di 4 studi ipercapnici per visita di studio ottenendo ~ 8 minuti di ipercapnia per visita di studio.

Catetere endovenoso Il personale di laboratorio addestrato inserirà due cateteri endovenosi (uno in ciascun braccio) per ogni visita di studio. Un catetere verrà utilizzato per l'infusione endovenosa dei farmaci in studio (L-NMMA, Ketorolac e acido ascorbico). Il secondo catetere verrà utilizzato per prelevare campioni di sangue intermittenti in 8 punti temporali specifici durante ogni visita di studio per garantire l'efficacia farmaceutica ed esaminare le variabili ematiche fisiologiche sistemiche di interesse. Il catetere utilizzato per i prelievi di sangue sarà mantenuto pervio con una flebo di soluzione fisiologica allo 0,9%. Se è possibile posizionare un solo catetere IV o uno fallisce, lo studio procederà sia con l'infusione del farmaco che con i prelievi di sangue che si verificano da un singolo catetere.

Infusione endovenosa di L-NMMA L'L-NMMA endovenoso è l'unico farmaco non approvato dalla FDA che verrà utilizzato, ma è comunemente utilizzato nell'ambito della ricerca. L'infusione endovenosa di L-NMMA sarà utilizzata per inibire l'enzima NOS responsabile della formazione di NO. L-NMMA è una polvere liofilizzata che viene diluita con soluzione salina. Nel presente studio, l'L-NMMA per via endovenosa verrà somministrato tramite una dose di carico di 3 mg kg-1 in 5 minuti (36 mg kg-1 ora-1), seguita da una dose di mantenimento di 1 mg kg-1 ora-1 per il resto dello studio. Considerando un tipico individuo di 75 kg, ciò si tradurrà in una dose di carico di 225 mg e una dose di mantenimento (~ 112 minuti) di 140 mg per un totale di 365 mg di L-NMMA per tutta la durata dello studio, quando L-NMMA è il primo farmaco in studio infuso (L -NMMA infuso durante HX1, HX2, HX3 e HC2, HC3, HC4). Durante la visita, quando L-NMMA è il secondo farmaco in studio infuso (L-NMMA infuso durante HX2, HX3 e HC3, HC4) il dosaggio totale sarà inferiore in quanto l'infusione di mantenimento (~67 min) sarà ridotta di ~45 minuti per un totale di 309 mg L-NMMA. La dose di carico di L-NMMA è equivalente a quella utilizzata in uno studio precedente che ha indagato il contributo della NOS alla vasodilatazione cerebrale ipossica, mentre la dose di mantenimento e la quantità assoluta di L-NMMA infusa saranno inferiori a quelle utilizzate in precedenza.

Infusione endovenosa di ketorolac Il ketorolac per via endovenosa è un farmaco antinfiammatorio non steroideo approvato dalla FDA utilizzato per il trattamento del dolore. Ketorolac sarà utilizzato per inibire in modo non specifico l'enzima cicloossigenasi responsabile della formazione di prostaglandine vasoattive (prostaciclina, trombossano). L'inibizione della sintesi delle prostaglandine durante l'ipossia permetterà di valutare il contributo di queste prostaglandine vasoattive alla vasodilatazione ipossica. Le comuni dosi endovenose di ketorolac sono infusioni in bolo da 15 mg e 30 mg; tuttavia, il ketorolac sarà dosato in relazione alla massa corporea. Ketorolac verrà somministrato per via endovenosa tramite una dose di carico di 0,3 mg kg-1 nell'arco di 5 minuti (3,6 mg kg-1 ora-1) con una dose di carico minima di 15 mg. Questo sarà quindi seguito da una dose di mantenimento di 0,03 mg kg-1 ora-1 per il resto dello studio. Considerando un tipico individuo di 75 kg, ciò si tradurrà in una dose di carico di 22,5 mg e una dose di mantenimento (~ 112 minuti) di 4,2 mg per un totale di 26,7 mg di ketorolac per tutta la durata dello studio, quando ketorolac è il primo farmaco in studio infuso (ketorolac infuso durante HX1, HX2, HX3 e HC2, HC3, HC4). Durante la visita in cui ketorolac è il secondo farmaco infuso in studio (ketorolac infuso durante HX2, HX3 e HC3, HC4) il dosaggio totale sarà inferiore in quanto l'infusione di mantenimento (~67 min) sarà ridotta di ~45 minuti per un totale di 25 mg di ketorolac. È stato dimostrato che dosi simili di ketorolac riducono i prostanoidi di tutto il corpo e riducono il dolore perioperatorio. Le concentrazioni plasmatiche di ketorolac raggiungono il picco entro ~3 minuti dopo la somministrazione endovenosa con un'emivita terminale di 5,6 ore.

Infusione endovenosa di acido ascorbico L'acido ascorbico endovenoso è approvato dalla FDA. L'acido ascorbico verrà somministrato per via endovenosa per ridurre in modo acuto i ROS. L'acido ascorbico verrà somministrato tramite una dose di carico di 0,035 g kg di massa magra-1 in 5 minuti (0,42 g kg di massa magra-1 ora-1). Seguito da una dose di mantenimento di 0,060 g/kg di massa magra-1 ora-1 durante il restante periodo di studio (~ 20 minuti) per la continua soppressione delle specie reattive dell'ossigeno. Considerando un individuo di 75 kg con una massa di tessuto senza grasso di ~ 55 kg (sulla base di precedenti soggetti giovani e sani nel nostro laboratorio), i soggetti riceveranno ~ 3,025 g di acido ascorbico nel corso di una visita di studio.

Analisi del plasma

Durante la visita di screening verranno prelevati ~ 10 ml di sangue come componente dell'ammissibilità allo studio. I campioni di sangue di screening saranno analizzati per glucosio venoso a digiuno, creatinina, colesterolo totale, colesterolo HDL, colesterolo LDL e trigliceridi. I campioni di sangue venoso verranno prelevati in 8 punti temporali durante il protocollo di studio tramite un catetere venoso. Ogni prelievo di sangue sarà di 10 ml, per un totale di 80 ml. Il sangue sarà centrifugato con plasma e siero prelevati e conservato a -80ºC. L'efficacia dell'inibizione della COX sarà determinata mediante la misurazione (EIA) dei metaboliti circolanti della COX 6-cheto-prostaglandina F1α (come marker stabile di PGI2) e trombossano B2 (un marker stabile di TXA2). L'efficacia dell'inibizione dei ROS sarà determinata dalle concentrazioni plasmatiche di vitamina C e dalle lipoproteine ​​ossidate a bassa densità (oxLDL) che fungono da marker sistemico dello stress ossidativo. È stato dimostrato che la somministrazione acuta di acido ascorbico per via endovenosa riduce l'oxLDL negli adulti sani. L'efficacia dell'inibizione di NOS sarà determinata dalla somma di nitriti e nitrati (NOx), che è considerato un indice della produzione di NO.