Indvirkning af NOS-, COX- og ROS-hæmning på cerebral blodgennemstrømning

Specifikke mål:

1A. Bestem de uafhængige bidrag fra NOS og COX til hypoxisk og hyperkapnisk vasodilatation i MCA hos unge, raske voksne.

1B. Bestem det kombinerede bidrag fra NOS og COX til hypoxisk og hyperkapnisk vasodilatation i MCA hos unge, raske voksne.

1. C. Bestem det kombinerede bidrag af NOS, COX og ROS til hypoxisk og hyperkapnisk vasodilatation i MCA hos unge, raske voksne.
2. A. Bestem de uafhængige bidrag fra NOS og COX til hypoxisk og hyperkapnisk vasodilatation i BA af unge, raske voksne.

2B. Bestem det kombinerede bidrag fra NOS og COX til hypoxisk og hyperkapnisk vasodilatation i BA hos unge, raske voksne.

2C. Bestem det kombinerede bidrag fra NOS, COX og ROS til hypoxisk og hyperkapnisk vasodilatation i BA hos unge, raske voksne.

Indledende screening: Et telefonscreeningsspørgeskema vil afgøre, om potentielle forsøgspersoner opfylder de foreløbige berettigelseskriterier. Potentielt kvalificerede emner vil blive inviteret til en yderligere personlig screening. Forsøgspersoner skal komme til screeningsbesøget efter at have fastet (undtagen vand) i minimum 10 timer.

Laboratoriescreeningsprocedurer omfatter:

1. Informeret samtykke
2. Sundhedshistorie spørgeskema
3. Spørgeskema om fysisk aktivitet
4. Uringraviditetstest (kun kvinder)
5. Venøst ​​blodudtag
6. DEXA-scanning (røntgenabsorptiometri med dobbelt energi)

Studiedesign: Kvalificerede forsøgspersoner vil gennemføre 2 studiebesøg, der undersøger hypoxiske og hyperkapniske reaktioner under fire betingelser: kontrol, NOS-hæmning eller COX-hæmning, NOS- og COX-hæmning og NOS-, COX- og ROS-hæmning. Under besøg 1 vil forsøgspersoner modtage L-NMMA (NG-Monomethyl-L-arginin; NOS-hæmning), ketorolac (COX-hæmning) og derefter ascorbinsyre (ROS-hæmning). Under besøg 2 vil forsøgspersoner modtage ketorolac, L-NMMA og derefter ascorbinsyre. Studiebesøg vil blive gennemført i en randomiseret, afbalanceret rækkefølge, og alle lægemidler vil blive infunderet intravenøst. Hypoxi vil fremkalde en SPO2~80% som bestemt ved pulsoximetri, og hypercapni vil øge end-tidal CO2 (PETCO2) med ~10 mmHg fra baseline. Under hvert besøg vil forsøgspersoner blive overvåget for hjertefrekvens, blodtryk, pulsoximetri-iltmætning, luftvejsgasser, ventilation og CBF-hastighed. Efter instrumentering og indsamling af baseline-data vil hypoxiske og hyperkapniske forsøg påbegyndes, hvor hastigheden af ​​den midterste cerebrale arterie (MCAv), basilær arteriehastighed (BAv), respiratoriske og kardiovaskulære variabler registreres. Alle forsøg vil blive adskilt af 10 minutters stille hvile, mens du indånder rumluft og vil ikke blive randomiseret på grund af rækkefølgen og timingen af ​​lægemiddelinfusioner, der kræves for at udforske vores mål. På grund af vanskeligheden ved at insonere BA, vil dette tjene som et udforskende mål og ikke anses for at være et nødvendigt resultat for studieafslutning.

Eksperimentelle metoder og interventionsplan:

Transkraniel Doppler Ultralyd (TCD) MCAv vil blive målt via det transtemporale vindue, mens BAv vil blive målt gennem det transforaminale vindue med 2-MHz (megahertz) transkranielle Doppler ultralydsonder. Hos ca. 30 % af individerne kan BA ikke identificeres; derfor vil insonation af MCA alene blive anset for tilstrækkeligt til at fortsætte med undersøgelsen i tilfælde, hvor BA ikke kan lokaliseres.

Målinger Højde og vægt vil blive målt for at beregne body mass index (BMI). Talje- og hofteomkredse vil blive målt som indikatorer for regional fedt. DEXA-scanning vil blive brugt til bestemmelse af kropssammensætning. Der vil blive udtaget venøse blodprøver til bestemmelse af blodkemiværdier. Under hvert besøg vil forsøgspersoner blive undersøgt i en semi-liggende stilling og instrumenteret til kontinuerlig måling af hjertefrekvens (3-aflednings-EKG), pulsoximetri iltmætning (SPO2, pulsoximeter) og blodtryk (MABP, automatiseret fysiologisk monitor) . Hæmodynamiske parametre vil løbende blive målt med fingerplethysmografi. Inspiratoriske og ekspiratoriske gasser vil blive målt med en gasanalysator, og respiratorisk flow vil blive bestemt med et opvarmet pneumotachometer.

Hypoxi Hypoxi vil blive brugt til at forårsage cerebral vasodilatation under hvilende, halvt liggende forhold. Tre isokapniske hypoxiforsøg vil blive udført pr. studiebesøg. Forsøgspersonerne vil inspirere gennem en tovejs ikke-genåndingsventil, forbundet til en gasblander, forsynet af medicinsk kvalitet tryksat oxygen (O2), kuldioxid (CO2) og nitrogen (N2). Efter 3 minutters basisindånding af rumluft vil hypoxi blive introduceret ved at reducere inspireret O2 (~11% O2) for at fremkalde og opretholde 3-minutters SPO2~80% som bestemt af et pulsoximeter. Efter 3 minutters baseline steady state hypoxi vil der være en 5-minutters lægemiddelpåfyldningsperiode (L-NMMA, ketoroloc eller ascorbinsyre), efterfulgt af en 5-minutters lægemiddelvedligeholdelsesperiode. Hypoxi vil blive opretholdt i løbet af denne tid, med en total hypoxi-varighed på ~15 minutter pr. hvert hypoxiforsøg. Isocapni vil blive opnået gennem tilsætning af CO2 til inspireret gas. End-tidal CO2 (PETCO2) har vist sig at være en valid prædiktor for arterielle blod CO2-niveauer. Tidligere data fra vores laboratorium indikerer, at steady state hypoxi opnås inden for 3 minutter. Derudover vil hypoxi, der fremkalder en SPO2~80%, blive undersøgt, da cerebrale kar har relativt lav cerebrovaskulær følsomhed over for mindre alvorlig hypoxi (SPO2~90%). I alt 3 hypoxiforsøg vil blive udført pr. studiebesøg, hvilket giver ~45 minutters steady state hypoxi.

Hyperkapni En stigning i systemisk CO2 er et kraftigt signal til at øge blodgennemstrømningen i det cerebrale kredsløb. I alt 4 hyperkapniske forsøg vil blive udført under hvert studiebesøg. Forsøgspersonerne vil inspirere gennem en tre-vejs glidende genåndingsventil fastgjort til en latexballon indeholdende en hyperoksisk (O2=40%), hyperkapnisk (CO2=3%) gasblanding med resten N2. Ballonen vil blive fyldt til et volumen, der overstiger den anslåede vitale kapacitet (som bestemt af alder, køn og højde) med 1 liter. Efter 3 minutters basisindånding af rumluft vil hyperkapni begynde ved at skubbe trevejs-genåndingsventilen fra rumluft til den påsatte latexballon. Under hyperkapni stiger PETCO2 (~10 mmHg over basislinjeværdierne), men indåndet O2 falder ikke under rumluftprocenten på 21 %. Hyperkapni vil blive opretholdt (~2 minutter), indtil PETCO2-værdierne når ~10 mmHg over baseline-værdierne, hvorefter forsøgspersonen begynder at indånde rumluft. PETCO2 vil blive brugt som et pålideligt, ikke-invasivt mål for arteriel CO2. I alt 4 hyperkapniske forsøg vil blive udført pr. studiebesøg, hvilket giver ~ 8 minutters hypercapni pr. undersøgelsesbesøg.

Intravenøst ​​kateter Uddannet laboratoriepersonale vil placere to intravenøse katetre (et i hver arm) for hvert studiebesøg. Et kateter vil blive brugt til intravenøs infusion af undersøgelsesmedicin (L-NMMA, Ketorolac og ascorbinsyre). Det andet kateter vil blive brugt til at tage intermitterende blodprøver på 8-specifikke tidspunkter under hvert studiebesøg for at sikre farmaceutisk effektivitet og undersøge systemiske fysiologiske blodvariabler af interesse. Kateteret, der bruges til blodudtagninger, vil blive holdt patenteret med et 0,9% saltvandsdryp. Hvis der kun kan placeres ét IV-kateter, eller et fejler, vil undersøgelsen fortsætte med både lægemiddelinfusion og blodudtagninger fra et enkelt kateter.

Intravenøs L-NMMA-infusion Intravenøs L-NMMA er det eneste ikke-FDA-godkendte lægemiddel, der vil blive brugt, men er almindeligt anvendt i forskningsmiljøet. Intravenøs infusion af L-NMMA vil blive brugt til at hæmme enzymet NOS, som er ansvarligt for dannelsen af ​​NO. L-NMMA er et frysetørret pulver, der er fortyndet med saltvand. I det aktuelle studie vil intravenøs L-NMMA blive administreret via en 3 mg kg-1 belastningsdosis over 5 minutter (36 mg kg-1 time-1), efterfulgt af en vedligeholdelsesdosis på 1 mg kg-1 time-1 for resten af ​​undersøgelsen. I betragtning af et typisk individ på 75 kg vil dette resultere i en startdosis på 225 mg og en vedligeholdelsesdosis (~112 min) på 140 mg på i alt 365 mg L-NMMA under hele undersøgelsens varighed, når L-NMMA er det første forsøgslægemiddel, der infunderes (L -NMMA infunderet under HX1, HX2, HX3 og HC2, HC3, HC4). Under besøget, når L-NMMA er infunderet med det andet undersøgelseslægemiddel (L-NMMA infunderet under HX2, HX3 og HC3, HC4), vil den samlede dosering være mindre, da vedligeholdelsesinfusionen (~67 min) vil blive reduceret med ~45 minutter i alt 309 mg L-NMMA. Ladningsdosis af L-NMMA svarer til den, der blev brugt i en tidligere undersøgelse, der undersøger bidraget af NOS til hypoxisk cerebral vasodilatation, mens vedligeholdelsesdosis og den absolutte mængde af L-NMMA infunderet vil være mindre end tidligere anvendt.

Intravenøs ketorolac-infusion Intravenøs ketorolac er FDA-godkendt ikke-steroidt antiinflammatorisk lægemiddel, der bruges til behandling af smerte. Ketorolac vil blive brugt til ikke-specifikt at hæmme enzymet cyclooxygenase, som er ansvarligt for dannelsen af ​​vasoaktive prostaglandiner (prostacyclin, thromboxan). Hæmning af prostaglandinsyntese under hypoxi vil tillade vurdering af disse vasoaktive prostaglandins bidrag til hypoxisk vasodilatation. Almindelige intravenøse doser af ketorolac er 15 mg og 30 mg bolusinfusioner; dog vil ketorolac blive doseret i forhold til kropsmasse. Ketorolac vil blive administreret intravenøst ​​via en 0,3 mg kg-1 startdosis over 5 minutter (3,6 mg kg-1 time-1) med en minimum startdosis på 15 mg. Dette vil derefter blive efterfulgt af en vedligeholdelsesdosis på 0,03 mg kg-1 time-1 for resten af ​​undersøgelsen. I betragtning af et typisk individ på 75 kg vil dette resultere i en startdosis på 22,5 mg og en vedligeholdelsesdosis (~112 min) på 4,2 mg på i alt 26,7 mg ketorolac under hele undersøgelsens varighed, når ketorolac er det første forsøgslægemiddel, der infunderes (ketorolac infunderet under HX1, HX2, HX3 og HC2, HC3, HC4). Under besøget, når ketorolac er det andet studielægemiddel infunderet ketorolac infunderet under HX2, HX3 og HC3, HC4), vil den samlede dosering være mindre, da vedligeholdelsesinfusionen (~67 min) vil blive reduceret med ~45 minutter til i alt 25 mg ketorolac. Lignende doser af ketorolac har vist sig at reducere prostanoider i hele kroppen og reducere perioperativ smerte. Plasma ketorolac-koncentrationer topper inden for ~3 minutter efter intravenøs administration med en terminal halveringstid på 5,6 timer.

Intravenøs ascorbinsyreinfusion Intravenøs ascorbinsyre er FDA-godkendt. Ascorbinsyre vil blive administreret intravenøst ​​for akut at reducere ROS. Ascorbinsyre vil blive indgivet via ladningsdosis på 0,035 g kg fedtfri masse-1 over 5 minutter (0,42 g kg fedtfri masse-1 time-1). Efterfulgt af en vedligeholdelsesdosis på 0,060 g kg fedtfri masse-1 time-1 over det resterende studietidsforløb (~20 minutter) for fortsat undertrykkelse af reaktive oxygenarter. I betragtning af et individ på 75 kg med en fedtfri vævsmasse på ~55 kg (baseret på tidligere unge, raske forsøgspersoner i vores laboratorium), vil forsøgspersoner modtage ~ 3,025 g ascorbinsyre i løbet af et studiebesøg.

Plasma assays

~10 ml blod vil blive udtaget under screeningsbesøget som en del af undersøgelsesberettigelsen. Screening af blodprøver vil blive analyseret for fastende venøs glukose, kreatinin, totalt kolesterol, HDL-kolesterol, LDL-kolesterol og triglycerider. Venøse blodprøver vil blive udtaget på 8 tidspunkter under undersøgelsesprotokollen via et venekateter. Hver blodprøve vil være 10 ml, i alt 80 ml. Blod vil blive centrifugeret med plasma og serum udtaget og opbevaret ved -80ºC. Effekten af ​​COX-hæmning vil blive bestemt ved måling (EIA) af de cirkulerende COX-metabolitter 6-keto-prostaglandin F1α (som stabil markør for PGI2) og thromboxan B2 (en stabil markør for TXA2). Effekten af ​​ROS-hæmning vil blive bestemt af plasma C-vitaminkoncentrationer og oxiderede lavdensitetslipoproteiner (oxLDL), der tjener som en systemisk markør for oxidativt stress. Akut intravenøs administration af ascorbinsyre har vist sig at reducere oxLDL hos raske voksne. Effekten af ​​NOS-hæmning vil blive bestemt af summen af ​​nitrit og nitrat (NOx), som anses for at være et indeks for NO-produktion.