Einfluss der NOS-, COX- und ROS-Hemmung auf die Regulierung des zerebralen Blutflusses

Spezifische Ziele:

1A. Bestimmen Sie die unabhängigen Beiträge von NOS und COX zur hypoxischen und hyperkapnischen Vasodilatation in der MCA junger, gesunder Erwachsener.

1B. Bestimmen Sie den kombinierten Beitrag von NOS und COX zur hypoxischen und hyperkapnischen Vasodilatation in der MCA junger, gesunder Erwachsener.

1. C. Bestimmen Sie den kombinierten Beitrag von NOS, COX und ROS zur hypoxischen und hyperkapnischen Vasodilatation in der MCA von jungen, gesunden Erwachsenen.
2. A. Bestimmung der unabhängigen Beiträge von NOS und COX zur hypoxischen und hyperkapnischen Vasodilatation im BA junger, gesunder Erwachsener.

2B. Bestimmen Sie den kombinierten Beitrag von NOS und COX zur hypoxischen und hyperkapnischen Vasodilatation im BA junger, gesunder Erwachsener.

2C. Bestimmen Sie den kombinierten Beitrag von NOS, COX und ROS zur hypoxischen und hyperkapnischen Vasodilatation im BA junger, gesunder Erwachsener.

Anfängliches Screening: Ein telefonischer Screening-Fragebogen bestimmt, ob potenzielle Probanden die vorläufigen Zulassungskriterien erfüllen oder nicht. Potenziell geeignete Probanden werden zu einem zusätzlichen persönlichen Screening eingeladen. Die Probanden müssen zum Screening-Besuch kommen, nachdem sie mindestens 10 Stunden lang (außer Wasser) gefastet haben.

Labor-Screening-Verfahren umfassen:

1. Einverständniserklärung
2. Fragebogen zur Krankengeschichte
3. Fragebogen zur körperlichen Aktivität
4. Urin-Schwangerschaftstest (nur Frauen)
5. Venöse Blutabnahme
6. DEXA-Scan (Dual-Energy-Röntgen-Absorptiometrie)

Studiendesign: Geeignete Probanden absolvieren 2 Studienbesuche, bei denen hypoxische und hyperkapnische Reaktionen unter vier Bedingungen untersucht werden: Kontrolle, NOS-Hemmung oder COX-Hemmung, NOS- und COX-Hemmung und NOS-, COX- und ROS-Hemmung. Während Besuch 1 erhalten die Probanden L-NMMA (NG-Monomethyl-L-Arginin; NOS-Hemmung), Ketorolac (COX-Hemmung) und dann Ascorbinsäure (ROS-Hemmung). Während Besuch 2 erhalten die Probanden Ketorolac, L-NMMA und dann Ascorbinsäure. Studienbesuche werden in einer randomisierten, ausgewogenen Reihenfolge durchgeführt und alle Medikamente werden intravenös infundiert. Hypoxie löst einen SPO2 von ~80 % aus, wie durch Pulsoximetrie bestimmt, und Hyperkapnie erhöht das endtidale CO2 (PETCO2) um ~10 mmHg gegenüber dem Ausgangswert. Während jedes Besuchs werden die Probanden auf Herzfrequenz, Blutdruck, Pulsoximetrie-Sauerstoffsättigung, Atemgase, Beatmung und CBF-Geschwindigkeit überwacht. Nach der Instrumentierung und der Erhebung von Basisdaten werden hypoxische und hyperkapnische Versuche beginnen, wobei die Geschwindigkeit der mittleren Hirnarterie (MCAv), die Geschwindigkeit der Basilararterie (BAv), respiratorische und kardiovaskuläre Variablen aufgezeichnet werden. Alle Studien werden durch eine 10-minütige ruhige Pause beim Atmen von Raumluft getrennt und werden aufgrund der Reihenfolge und des Zeitpunkts der Arzneimittelinfusionen, die zur Erforschung unserer Ziele erforderlich sind, nicht randomisiert. Aufgrund der Schwierigkeit, den BA zu beschallen, dient dies als exploratives Ziel und wird nicht als notwendiges Ergebnis für den Studienabschluss angesehen.

Experimentelle Methoden und Interventionsplan:

Transkranieller Doppler-Ultraschall (TCD) MCAv wird über das transtemporale Fenster gemessen, während BAv durch das transforaminale Fenster mit 2-MHz (Megahertz) transkraniellen Doppler-Ultraschallsonden gemessen wird. Bei etwa 30 % der Personen kann die BA nicht identifiziert werden; Daher wird in Fällen, in denen BA nicht lokalisiert werden kann, die Beschallung des MCA allein als ausreichend angesehen, um mit der Studie fortzufahren.

Messungen Größe und Gewicht werden gemessen, um den Body-Mass-Index (BMI) zu berechnen. Taillen- und Hüftumfang werden als Indikatoren der regionalen Adipositas gemessen. Der DEXA-Scan wird zur Bestimmung der Körperzusammensetzung verwendet. Zur Bestimmung der Blutchemiewerte werden venöse Blutproben entnommen. Bei jedem Besuch werden die Probanden in einer halb liegenden Position untersucht und für die kontinuierliche Messung der Herzfrequenz (3-Kanal-EKG), der Pulsoximetrie-Sauerstoffsättigung (SPO2, Pulsoximeter) und des Blutdrucks (MABP, automatisierter physiologischer Monitor) instrumentiert. . Hämodynamische Parameter werden kontinuierlich mit Fingerplethysmographie gemessen. In- und Exspirationsgase werden mit einem Gasanalysator gemessen und der Atemfluss wird mit einem beheizten Pneumotachometer bestimmt.

Hypoxie Hypoxie wird verwendet, um eine zerebrale Vasodilatation unter ruhenden, halb liegenden Bedingungen zu bewirken. Pro Studienbesuch werden drei isokapnische Hypoxie-Versuche durchgeführt. Die Probanden werden durch ein Zweiwege-Rückatmungsventil inspiriert, das mit einem Gasmischer verbunden ist und mit medizinischem Drucksauerstoff (O2), Kohlendioxid (CO2) und Stickstoff (N2) versorgt wird. Nach 3 Minuten Grundlinien-Raumluftatmung wird eine Hypoxie eingeführt, indem der eingeatmete O2 (~11 % O2) verringert wird, um 3 Minuten lang SPO2~80 %, wie durch ein Pulsoximeter bestimmt, hervorzurufen und aufrechtzuerhalten. Nach 3 Minuten Baseline-Steady-State-Hypoxie folgt eine 5-minütige Beladungsphase mit Medikamenten (L-NMMA, Ketoroloc oder Ascorbinsäure), gefolgt von einer 5-minütigen Erhaltungsphase mit Medikamenten. Die Hypoxie wird während dieser Zeit aufrechterhalten, mit einer Gesamthypoxiedauer von ~15 Minuten pro Hypoxieversuch. Isokapnie wird durch die Zugabe von CO2 zum eingeatmeten Gas erreicht. Das endexspiratorische CO2 (PETCO2) hat sich als gültiger Prädiktor für die arteriellen Blut-CO2-Spiegel erwiesen. Frühere Daten aus unserem Labor zeigen, dass eine stationäre Hypoxie innerhalb von 3 Minuten erreicht wird. Zusätzlich wird Hypoxie, die einen SPO2~80% hervorruft, untersucht, da zerebrale Gefäße eine relativ geringe zerebrovaskuläre Empfindlichkeit gegenüber weniger schwerer Hypoxie (SPO2~90%) haben. Pro Studienbesuch werden insgesamt 3 Hypoxie-Versuche durchgeführt, die ~45 Minuten Steady-State-Hypoxie ergeben.

Hyperkapnie Ein Anstieg des systemischen CO2 ist ein starkes Signal, um den Blutfluss im zerebralen Kreislauf zu erhöhen. Bei jedem Studienbesuch werden insgesamt 4 hyperkapnische Studien durchgeführt. Die Probanden werden durch ein Dreiwege-Rückatemventil, das an einem Latexballon befestigt ist, der ein hyperoxisches (O2 = 40 %), hyperkapnisches (CO2 = 3 %) Gasgemisch mit dem Rest N2 enthält, inspiriert. Der Ballon wird bis zu einem Volumen gefüllt, das die geschätzte Vitalkapazität (bestimmt durch Alter, Geschlecht und Größe) um 1 Liter übersteigt. Nach 3 Minuten Grundlinien-Raumluftatmung beginnt die Hyperkapnie, indem das Dreiwege-Rückatemventil von der Raumluft zum angeschlossenen Latexballon geschoben wird. Während Hyperkapnie steigt PETCO2 an (~10 mmHg über den Ausgangswerten), aber der eingeatmete O2 fällt nicht unter den Raumluftanteil von 21 %. Die Hyperkapnie wird aufrechterhalten (ca. 2 Minuten), bis die PETCO2-Werte ca. 10 mmHg über den Ausgangswerten liegen, wonach das Subjekt beginnt, Raumluft zu atmen. PETCO2 wird als zuverlässiges, nicht-invasives Maß für arterielles CO2 verwendet. Pro Studienbesuch werden insgesamt 4 Hyperkapnie-Studien durchgeführt, was zu ~ 8 Minuten Hyperkapnie pro Studienbesuch führt.

Intravenöser Katheter Geschultes Laborpersonal platziert bei jedem Studienbesuch zwei intravenöse Katheter (einen in jedem Arm). Ein Katheter wird für die intravenöse Infusion von Studienmedikamenten (L-NMMA, Ketorolac und Ascorbinsäure) verwendet. Der zweite Katheter wird verwendet, um intermittierende Blutproben zu 8 bestimmten Zeitpunkten während jedes Studienbesuchs zu entnehmen, um die pharmazeutische Wirksamkeit sicherzustellen und interessierende systemische physiologische Blutvariablen zu untersuchen. Der für die Blutentnahmen verwendete Katheter wird mit einem Tropf mit 0,9 %iger Kochsalzlösung offen gehalten. Wenn nur ein IV-Katheter platziert werden kann oder einer versagt, wird die Studie sowohl mit der Arzneimittelinfusion als auch mit den Blutentnahmen aus einem einzigen Katheter fortgesetzt.

Intravenöse L-NMMA-Infusion Intravenöses L-NMMA ist das einzige nicht von der FDA zugelassene Medikament, das verwendet wird, wird jedoch häufig in der Forschung eingesetzt. Durch intravenöse Infusion von L-NMMA wird das Enzym NOS, das für die Bildung von NO verantwortlich ist, gehemmt. L-NMMA ist ein lyophilisiertes Pulver, das mit Kochsalzlösung verdünnt wird. In der aktuellen Studie wird intravenöses L-NMMA über eine Aufsättigungsdosis von 3 mg kg-1 über 5 Minuten (36 mg kg-1 h-1) verabreicht, gefolgt von einer Erhaltungsdosis von 1 mg kg-1 h-1 für den Rest des Studiums. Betrachtet man eine typische Person mit 75 kg, führt dies zu einer Aufsättigungsdosis von 225 mg und einer Erhaltungsdosis (~112 min) von 140 mg, was insgesamt 365 mg L-NMMA während der gesamten Dauer der Studie entspricht, wenn L-NMMA das erste infundierte Studienmedikament ist (L -NMMA infundiert während HX1, HX2, HX3 und HC2, HC3, HC4). Während des Besuchs, wenn L-NMMA als zweites Studienmedikament infundiert wird (L-NMMA infundiert während HX2, HX3 und HC3, HC4), wird die Gesamtdosierung geringer sein, da die Erhaltungsinfusion (~67 min) um ~45 Minuten auf insgesamt 309 reduziert wird mg L-NMMA. Die Aufsättigungsdosis von L-NMMA entspricht derjenigen, die in einer früheren Studie verwendet wurde, die den Beitrag von NOS zur hypoxischen zerebralen Vasodilatation untersuchte, während die Erhaltungsdosis und die absolute Menge an infundiertem L-NMMA geringer sein werden als zuvor verwendet.

Intravenöse Ketorolac-Infusion Intravenöses Ketorolac ist ein von der FDA zugelassenes nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament zur Behandlung von Schmerzen. Ketorolac wird verwendet, um das Enzym Cyclooxygenase, das für die Bildung vasoaktiver Prostaglandine (Prostacyclin, Thromboxan) verantwortlich ist, unspezifisch zu hemmen. Die Hemmung der Prostaglandin-Synthese während Hypoxie ermöglicht die Bewertung des Beitrags dieser vasoaktiven Prostaglandine zur hypoxischen Vasodilatation. Übliche intravenöse Dosen von Ketorolac sind 15 mg und 30 mg Bolusinfusionen; Ketorolac wird jedoch relativ zur Körpermasse dosiert. Ketorolac wird intravenös über eine Aufsättigungsdosis von 0,3 mg kg-1 über 5 Minuten (3,6 mg kg-1 h-1) mit einer minimalen Aufsättigungsdosis von 15 mg verabreicht. Danach folgt für den Rest der Studie eine Erhaltungsdosis von 0,03 mg kg-1 h-1. Betrachtet man eine typische Person mit 75 kg, führt dies zu einer Aufsättigungsdosis von 22,5 mg und einer Erhaltungsdosis (~112 min) von 4,2 mg, insgesamt 26,7 mg Ketorolac während der gesamten Dauer der Studie, wenn Ketorolac das erste Studienmedikament ist, das infundiert wird (Ketorolac wird währenddessen infundiert). HX1, HX2, HX3 und HC2, HC3, HC4). Während des Besuchs, wenn Ketorolac das zweite infundierte Studienmedikament ist (Ketorolac infundiert während HX2, HX3 und HC3, HC4), wird die Gesamtdosierung geringer sein, da die Erhaltungsinfusion (~67 min) um ~45 Minuten auf insgesamt 25 mg Ketorolac reduziert wird. Es hat sich gezeigt, dass ähnliche Ketorolac-Dosen Ganzkörper-Prostanoide und perioperative Schmerzen reduzieren. Plasmakonzentrationen von Ketorolac erreichen innerhalb von ~3 Minuten nach intravenöser Verabreichung mit einer terminalen Halbwertszeit von 5,6 Stunden ihren Höhepunkt.

Intravenöse Ascorbinsäure-Infusion Intravenöse Ascorbinsäure ist von der FDA zugelassen. Ascorbinsäure wird intravenös verabreicht, um ROS akut zu reduzieren. Ascorbinsäure wird über eine Ladedosis von 0,035 g kg fettfreie Masse –1 über 5 Minuten (0,42 g kg fettfreie Masse –1 h –1 ) verabreicht. Gefolgt von einer Erhaltungsdosis von 0,060 g/kg fettfreier Masse – 1 Stunde –1 über den verbleibenden Studienzeitverlauf (~20 Minuten) zur fortgesetzten Unterdrückung reaktiver Sauerstoffspezies. Betrachtet man eine 75 kg schwere Person mit einer fettfreien Gewebemasse von ~55 kg (basierend auf früheren jungen, gesunden Probanden in unserem Labor), erhalten die Probanden im Verlauf eines Studienbesuchs ~ 3,025 g Ascorbinsäure.

Plasma-Assays

Als Bestandteil der Eignung für die Studie werden während des Screening-Besuchs ~10 ml Blut entnommen. Screening-Blutproben werden auf Nüchternblutzucker, Kreatinin, Gesamtcholesterin, HDL-Cholesterin, LDL-Cholesterin und Triglyceride analysiert. Venöse Blutproben werden zu 8 Zeitpunkten während des Studienprotokolls über einen Venenkatheter entnommen. Jede Blutentnahme beträgt 10 ml, insgesamt also 80 ml. Blut wird mit abgezogenem Plasma und Serum zentrifugiert und bei -80°C gelagert. Die Wirksamkeit der COX-Hemmung wird durch die Messung (EIA) der zirkulierenden COX-Metaboliten 6-Keto-Prostaglandin F1α (als stabiler Marker von PGI2) und Thromboxan B2 (ein stabiler Marker von TXA2) bestimmt. Die Wirksamkeit der ROS-Hemmung wird durch Plasma-Vitamin-C-Konzentrationen und oxidierte Low-Density-Lipoproteine ​​(oxLDL) bestimmt, die als systemischer Marker für oxidativen Stress dienen. Es wurde gezeigt, dass die akute intravenöse Verabreichung von Ascorbinsäure oxLDL bei gesunden Erwachsenen senkt. Die Wirksamkeit der NOS-Hemmung wird durch die Summe von Nitrit und Nitrat (NOx) bestimmt, die als Index für die NO-Produktion angesehen wird.