NOS:n, COX:n ja ROS:n estämisen vaikutus aivojen verenvirtauksen säätelyyn

Erityiset tavoitteet:

1A. Selvitä NOS:n ja COX:n riippumaton vaikutus hypoksiseen ja hyperkapniseen vasodilataatioon nuorten terveiden aikuisten MCA:ssa.

1B. Selvitä NOS:n ja COX:n yhdistetty vaikutus hypoksiseen ja hyperkapniseen verisuonten laajenemiseen nuorten terveiden aikuisten MCA:ssa.

1. C. Määritä NOS:n, COX:n ja ROS:n yhteisvaikutus hypoksiseen ja hyperkapniseen vasodilataatioon nuorten terveiden aikuisten MCA:ssa.
2. A. Määritä NOS:n ja COX:n riippumaton vaikutus hypoksiseen ja hyperkapniseen vasodilataatioon nuorten terveiden aikuisten BA:ssa.

2B. Selvitä NOS:n ja COX:n yhteisvaikutus hypoksiseen ja hyperkapniseen vasodilataatioon nuorten terveiden aikuisten BA:ssa.

2C. Selvitä NOS:n, COX:n ja ROS:n yhteisvaikutus hypoksiseen ja hyperkapniseen verisuonten laajenemiseen nuorten, terveiden aikuisten BA:ssa.

Alkuseulonta: Puhelinseulontakyselyllä selvitetään, täyttävätkö mahdolliset koehenkilöt alustavat kelpoisuusvaatimukset. Mahdollisesti kelvolliset koehenkilöt kutsutaan ylimääräiseen henkilökohtaiseen seulomiseen. Tutkittavien tulee tulla seulontakäynnille paastottuaan (paitsi vettä) vähintään 10 tuntia.

Laboratoriotutkimukset sisältävät:

1. Tietoinen suostumus
2. Terveyshistorian kyselylomake
3. Liikuntakyselylomake
4. Virtsan raskaustesti (vain naiset)
5. Laskimoverenotto
6. DEXA-skannaus (kaksoisenergiaröntgenabsorptiometria)

Tutkimuksen suunnittelu: Sopivat tutkittavat suorittavat 2 tutkimuskäyntiä, joissa tutkitaan hypoksisia ja hyperkapnisia vasteita neljässä tilanteessa: kontrolli, NOS:n esto tai COX-inhibitio, NOS- ja COX-inhibitio sekä NOS-, COX- ja ROS-inhibitio. Vierailun 1 aikana koehenkilöt saavat L-NMMA:ta (NG-Monometyyli-L-arginiini; NOS:n esto), ketorolaakia (COX-inhibitio) ja sitten askorbiinihappoa (ROS-inhibitio). Vierailun 2 aikana koehenkilöt saavat ketorolaakia, L-NMMA:ta ja sitten askorbiinihappoa. Opintokäynnit tehdään satunnaistetussa, tasapainotetussa järjestyksessä ja kaikki lääkkeet infusoidaan suonensisäisesti. Hypoksia saa aikaan SPO2:n ~ 80 % pulssioksimetrialla määritettynä ja hyperkapnia lisää loppuhengityksen CO2:ta (PETCO2) ~10 mmHg:llä lähtötasosta. Jokaisen käynnin aikana koehenkilöitä seurataan sykkeen, verenpaineen, pulssioksimetrian happisaturaation, hengityskaasujen, ventilaation ja CBF:n nopeuden suhteen. Instrumentoinnin ja perustietojen keruun jälkeen hypoksiset ja hyperkapniset kokeet aloitetaan siten, että keskimmäisen aivovaltimon nopeus (MCAv), tyvivaltimon nopeus (BAv), hengitys- ja kardiovaskulaariset muuttujat tallennetaan. Kaikki kokeet erotetaan 10 minuutin hiljaisella lepolla huoneilmaa hengitettäessä, eikä niitä satunnaisteta tavoitteidemme tutkimiseen tarvittavien lääkeinfuusioiden järjestyksen ja ajoituksen vuoksi. BA:n insonoinnin vaikeuden vuoksi tämä toimii tutkivana tavoitteena, eikä sitä pidetä välttämättömänä tuloksena opintojen suorittamisen kannalta.

Koemenetelmät ja interventiosuunnitelma:

Transkraniaalinen Doppler-ultraääni (TCD) MCAv mitataan transtemporaalisen ikkunan kautta, kun taas BAv mitataan transforaminaalisen ikkunan kautta 2 MHz:n (megahertsin) transkraniaalisilla Doppler-ultraääniantureilla. Noin 30 %:lla henkilöistä BA:ta ei voida tunnistaa; siksi pelkkä MCA:n insonointi katsotaan riittäväksi tutkimuksen jatkamiseksi tapauksissa, joissa BA:ta ei voida paikantaa.

Mittaukset Pituus ja paino mitataan painoindeksin (BMI) laskemiseksi. Vyötärön ja lantion ympärysmitta mitataan alueellisen lihavuuden indikaattoreina. DEXA-skannausta käytetään kehon koostumuksen määrittämiseen. Laskimoverinäytteet otetaan veren kemiallisten arvojen määrittämiseksi. Jokaisen käynnin aikana koehenkilöitä tutkitaan puolimakaavassa asennossa ja instrumentoidaan jatkuvaan sydämen sykkeen (3-kytkentäinen EKG), pulssioksimetrian happisaturaation (SPO2, pulssioksimetri) ja verenpaineen (MABP, automaattinen fysiologinen monitori) mittaamiseen. . Hemodynaamisia parametreja mitataan jatkuvasti sormen pletysmografialla. Sisään- ja uloshengityskaasut mitataan kaasuanalysaattorilla ja hengitysvirtaus lämmitetyllä pneumotakometrillä.

Hypoksia Hypoksiaa käytetään aiheuttamaan aivojen verisuonten laajenemista levossa, puolimakaavissa olosuhteissa. Yhtä tutkimuskäyntiä kohden suoritetaan kolme isokapnista hypoksiakoetta. Koehenkilöt hengittävät kaksisuuntaisen ei-uudelleenhengittävän venttiilin kautta, joka on yhdistetty kaasusekoittimeen ja jota syötetään lääketieteellisen luokan paineistetun hapen (O2), hiilidioksidin (CO2) ja typen (N2) kautta. Kolmen minuutin huoneilman perushengityksen jälkeen hypoksia saadaan aikaan vähentämällä hengitettyä O2:ta (~11 % O2) 3 minuutin SPO2-80 %:n aikaansaamiseksi ja ylläpitämiseksi pulssioksimetrillä määritettynä. 3 minuutin perustilan vakaan tilan hypoksian jälkeen tulee 5 minuutin lääkelatausjakso (L-NMMA, ketorolokki tai askorbiinihappo), jota seuraa 5 minuutin lääkkeen ylläpitojakso. Hypoksia säilyy tänä aikana, ja hypoksian kokonaiskesto on ~15 minuuttia jokaista hypoksiakoetta kohden. Isokapnia saavutetaan lisäämällä CO2:ta sisäänhengitettyyn kaasuun. End-tidal CO2 (PETCO2) on osoitettu olevan validi ennustaja valtimoveren CO2-tasoja. Laboratoriostamme saadut aikaisemmat tiedot osoittavat, että vakaan tilan hypoksia saavutetaan 3 minuutissa. Lisäksi tutkitaan hypoksia, joka aiheuttaa SPO2-80 %, koska aivoverisuonien herkkyys lievemmälle hypoksialle (SPO2-90 %) on suhteellisen alhainen. Tutkimuskäyntiä kohden suoritetaan yhteensä 3 hypoksiakoetta, jotka tuottavat ~45 minuuttia vakaan tilan hypoksiaa.

Hyperkapnia Systeemisen CO2-pitoisuuden nousu on voimakas signaali lisäämään verenkiertoa aivoverenkierrossa. Jokaisen tutkimuskäynnin aikana suoritetaan yhteensä 4 hyperkapnista koetta. Koehenkilöt hengittävät kolmisuuntaisen liukuvan uudelleenhengitysventtiilin kautta, joka on kiinnitetty lateksipalloon, joka sisältää hyperoksista (O2 = 40 %), hyperkapnista (CO2 = 3 %) kaasuseosta loppuosan N2 kanssa. Ilmapallo täytetään tilavuuteen, joka ylittää arvioidun vitaalikapasiteetin (iän, sukupuolen ja pituuden mukaan) 1 litralla. Kolmen minuutin huoneilman perushengityksen jälkeen hyperkapnia alkaa liu'uttamalla kolmitiehengitysventtiili huoneilmasta kiinnitettyyn lateksipalloon. Hyperkapnian aikana PETCO2 nousee (~10 mmHg perusarvojen yläpuolelle), mutta inspiroitu O2 ei laske alle 21 %:n huoneilman prosenttiosuuden. Hyperkapnia jatkuu (noin 2 minuuttia), kunnes PETCO2-arvot saavuttavat ~10 mmHg perusarvot, minkä jälkeen koehenkilö alkaa hengittää huoneilmaa. PETCO2:ta käytetään luotettavana, ei-invasiivisena valtimoiden CO2-mittauksena. Tutkimuskäyntiä kohden suoritetaan yhteensä 4 hyperkapniatutkimusta, jotka tuottavat ~ 8 minuuttia hyperkapniaa tutkimuskäyntiä kohden.

Laskimonsisäinen katetri Koulutettu laboratoriohenkilöstö asettaa kaksi suonensisäistä katetria (yksi kumpaankin käsivarteen) jokaista tutkimuskäyntiä varten. Yhtä katetria käytetään tutkimuslääkkeiden (L-NMMA, ketorolaakki ja askorbiinihappo) suonensisäiseen infuusioon. Toista katetria käytetään ottamaan jaksottaisia ​​verinäytteitä 8 tietyssä ajankohdassa jokaisen tutkimuskäynnin ajan farmaseuttisen tehokkuuden varmistamiseksi ja kiinnostavien systeemisten fysiologisten veren muuttujien tutkimiseksi. Verenoton katetri säilytetään patentoituna 0,9 % suolaliuoksella. Jos vain yksi suonensisäinen katetri voidaan asettaa tai toinen epäonnistuu, tutkimus jatkuu sekä lääkeinfuusiolla että veren ottolla yhdestä katetrista.

Laskimonsisäinen L-NMMA-infuusio Suonensisäinen L-NMMA on ainoa ei-FDA:n hyväksymä lääke, jota käytetään, mutta jota käytetään yleisesti tutkimusympäristössä. L-NMMA:n suonensisäistä infuusiota käytetään estämään NOS-entsyymiä, joka on vastuussa NO:n muodostumisesta. L-NMMA on lyofilisoitu jauhe, joka laimennetaan suolaliuoksella. Tässä tutkimuksessa suonensisäistä L-NMMA:ta annetaan 3 mg kg-1 kyllästysannoksena 5 minuutin aikana (36 mg kg-1 h-1), jota seuraa ylläpitoannos 1 mg kg-1 h-1. loppuosan opiskelusta. Kun otetaan huomioon tyypillinen 75 kg painava yksilö, tämä johtaa 225 mg:n kyllästysannokseen ja 140 mg:n ylläpitoannokseen (~112 min) yhteensä 365 mg L-NMMA:ta koko tutkimuksen ajan, kun L-NMMA on ensimmäinen infusoitu tutkimuslääke (L). -NMMA infusoituna HX1, HX2, HX3 ja HC2, HC3, HC4 aikana). Vierailun aikana, kun L-NMMA on toinen tutkimuslääkeinfuusio (L-NMMA infusoitu HX2:n, HX3:n ja HC3:n, HC4:n aikana), kokonaisannostus on pienempi, koska ylläpitoinfuusio (~67 min) pienenee noin 45 minuutilla yhteensä 309 mg L-NMMA:ta. L-NMMA:n kyllästysannos vastaa sitä, jota käytettiin aikaisemmassa tutkimuksessa, jossa tutkittiin NOS:n osuutta hypoksiseen aivoverisuonten laajentumiseen, kun taas ylläpitoannos ja infusoidun L-NMMA:n absoluuttinen määrä ovat pienempiä kuin aiemmin käytetty.

Laskimonsisäinen ketorolakki-infuusio Suonensisäinen ketorolakki on FDA:n hyväksymä ei-steroidinen tulehduskipulääke, jota käytetään kivun hoitoon. Ketorolakia käytetään epäspesifisesti estämään syklo-oksigenaasientsyymiä, joka on vastuussa vasoaktiivisten prostaglandiinien (prostasykliini, tromboksaani) muodostumisesta. Prostaglandiinien synteesin estäminen hypoksian aikana mahdollistaa näiden vasoaktiivisten prostaglandiinien vaikutuksen arvioinnin hypoksiseen vasodilataatioon. Ketorolakin yleiset suonensisäiset annokset ovat 15 mg ja 30 mg bolusinfuusiot; Ketorolakia kuitenkin annostellaan suhteessa kehon painoon. Ketorolakia annetaan suonensisäisesti 0,3 mg:n kg-1 kyllästysannoksella 5 minuutin aikana (3,6 mg kg-1 h-1) ja vähimmäislatausannos on 15 mg. Tätä seuraa sitten ylläpitoannos 0,03 mg kg-1 h-1 tutkimuksen loppuosan ajan. Kun otetaan huomioon tyypillinen 75 kg painava yksilö, tämä johtaa 22,5 mg:n kyllästysannokseen ja 4,2 mg:n ylläpitoannokseen (~112 min) eli yhteensä 26,7 mg ketorolaakia koko tutkimuksen ajan, kun ketorolaakki on ensimmäinen infusoitu tutkimuslääke (ketorolaakki infusoituna aikana HX1, HX2, HX3 ja HC2, HC3, HC4). Vierailun aikana, kun ketorolakki on toinen tutkimuslääkeinfusoitu ketorolakki, jota infusoidaan HX2:n, HX3:n ja HC3:n, HC4:n aikana, kokonaisannostus on pienempi, koska ylläpitoinfuusio (~67 min) pienenee ~45 minuutilla eli yhteensä 25 mg ketorolakia. Samanlaisten ketorolakkiannosten on osoitettu vähentävän koko kehon prostanoideja ja vähentävän perioperatiivista kipua. Plasman ketorolaakin pitoisuudet saavuttavat huippunsa noin 3 minuutissa suonensisäisen annon jälkeen, ja terminaalinen puoliintumisaika on 5,6 tuntia.

Laskimonsisäinen askorbiinihappo-infuusio Laskimonsisäinen askorbiinihappo on FDA:n hyväksymä. Askorbiinihappoa annetaan suonensisäisesti ROS:n vähentämiseksi. Askorbiinihappoa annostellaan 0,035 g kg rasvatonta massaa-1 5 minuutin aikana (0,42 g kg rasvatonta massaa-1 h-1). Sen jälkeen annettiin ylläpitoannos 0,060 g kg rasvatonta massaa-1 h-1 jäljellä olevan tutkimusajan aikana (n. 20 minuuttia) reaktiivisten happilajien jatkuvan tukahduttamiseksi. Kun otetaan huomioon 75 kg painava yksilö, jonka rasvaton kudosmassa on ~55 kg (perustuen aikaisempien nuorten, terveiden koehenkilöiden laboratoriossa), koehenkilöt saavat ~ 3,025 g askorbiinihappoa opintokäynnin aikana.

Plasmamääritykset

Seulontakäynnin aikana otetaan noin 10 ml verta osana tutkimuskelpoisuutta. Seulontaverinäytteistä analysoidaan paastolaskimon glukoosi, kreatiniini, kokonaiskolesteroli, HDL-kolesteroli, LDL-kolesteroli ja triglyseridit. Laskimoverinäytteet otetaan 8 ajankohtana tutkimusprotokollan aikana laskimokatetrin kautta. Jokainen verenotto on 10 ml, yhteensä 80 ml. Veri sentrifugoidaan plasmalla ja seerumi otetaan pois ja säilytetään -80 ºC:ssa. COX-estämisen tehokkuus määritetään mittaamalla (EIA) verenkierrossa olevat COX-metaboliitit 6-keto-prostaglandiini F1α (stabiilina PGI2-markkerina) ja tromboksaani B2 (stabiili TXA2-markkeri). ROS-estämisen tehokkuus määräytyy plasman C-vitamiinipitoisuuksien ja oksidatiivisen stressin systeemisenä merkkiaineena toimivien hapettuneiden matalatiheyksisten lipoproteiinien (oxLDL) perusteella. Akuutin suonensisäisen askorbiinihapon antamisen on osoitettu vähentävän oxLDL-arvoja terveillä aikuisilla. NOS:n estämisen tehokkuus määritetään nitriitin ja nitraatin (NOx) summalla, jota pidetään NO-tuotannon indeksinä.