Vliv inhibice NOS, COX a ROS na regulaci průtoku krve mozkem

Konkrétní cíle:

1A. Určete nezávislé příspěvky NOS a COX k hypoxické a hyperkapnické vazodilataci u MCA mladých zdravých dospělých.

1B. Určete kombinovaný příspěvek NOS a COX k hypoxické a hyperkapnické vazodilataci u MCA mladých zdravých dospělých.

1. C. Určete kombinovaný příspěvek NOS, COX a ROS k hypoxické a hyperkapnické vazodilataci u MCA mladých zdravých dospělých.
2. A. Určete nezávislé příspěvky NOS a COX k hypoxické a hyperkapnické vazodilataci v BA u mladých zdravých dospělých.

2B. Určete kombinovaný příspěvek NOS a COX k hypoxické a hyperkapnické vazodilataci u BA mladých zdravých dospělých.

2C. Určete kombinovaný příspěvek NOS, COX a ROS k hypoxické a hyperkapnické vazodilataci v BA u mladých zdravých dospělých.

Počáteční screening: Telefonní screeningový dotazník určí, zda potenciální subjekty splňují předběžná kritéria způsobilosti. Potenciálně způsobilé subjekty budou pozvány na další osobní prohlídku. Subjekty budou muset přijít na screeningovou návštěvu s hladověním (kromě vody) po dobu minimálně 10 hodin.

Laboratorní screeningové postupy zahrnují:

1. Informovaný souhlas
2. Zdravotní anamnéza dotazník
3. Dotazník pohybové aktivity
4. Těhotenský test z moči (pouze ženy)
5. Odběr žilní krve
6. DEXA scan (duální rentgenová absorbometrie)

Plán studie: Způsobilé subjekty absolvují 2 studijní návštěvy zkoumající hypoxické a hyperkapnické reakce za čtyř podmínek: kontrola, inhibice NOS nebo inhibice COX, inhibice NOS a COX a inhibice NOS, COX a ROS. Během návštěvy 1 budou subjekty dostávat L-NMMA (NG-monomethyl-L-arginin; inhibice NOS), ketorolac (inhibice COX), poté kyselinu askorbovou (inhibice ROS). Během návštěvy 2 dostanou subjekty ketorolac, L-NMMA a poté kyselinu askorbovou. Studijní návštěvy budou prováděny v randomizovaném, vyváženém pořadí a všechny léky budou podávány intravenózní infuzí. Hypoxie vyvolá SPO2~80 %, jak bylo stanoveno pulzní oxymetrií, a hyperkapnie zvýší end-tidal CO2 (PETCO2) o ~10 mmHg oproti výchozí hodnotě. Během každé návštěvy bude u subjektů monitorována srdeční frekvence, krevní tlak, saturace kyslíkem pulzní oxymetrií, dýchací plyny, ventilace a rychlost CBF. Po přístrojovém vybavení a sběru výchozích dat začnou hypoxické a hyperkapnické studie se zaznamenáváním proměnných rychlosti střední cerebrální arterie (MCAv), rychlosti bazilární arterie (BAv), respiračních a kardiovaskulárních proměnných. Všechny studie budou odděleny 10 minutami tichého odpočinku při dýchání vzduchu v místnosti a nebudou náhodně rozděleny kvůli pořadí a načasování infuzí léků, které jsou potřebné k prozkoumání našich cílů. Vzhledem k obtížnosti insonace BA to bude sloužit jako průzkumný cíl a nebude považováno za nezbytný výsledek pro dokončení studia.

Experimentální metody a plán intervence:

Transkraniální dopplerovský ultrazvuk (TCD) MCAv bude měřen transtemporálním okénkem, zatímco BAv bude měřen transforaminálním okénkem pomocí 2-MHz (megahertz) transkraniálních dopplerovských ultrazvukových sond. U přibližně 30 % jedinců nelze BA identifikovat; proto bude insonace samotného MCA považována za dostatečnou pro pokračování studie v případech, kdy BA nelze najít.

Měření Pro výpočet indexu tělesné hmotnosti (BMI) bude měřena výška a hmotnost. Jako indikátory regionální adipozity budou měřeny obvody pasu a boků. DEXA scan bude použit pro stanovení tělesného složení. Pro stanovení biochemických hodnot krve budou odebrány vzorky žilní krve. Během každé návštěvy budou subjekty studovány v pololeže a vybavené přístroji pro kontinuální měření srdeční frekvence (3svodové EKG), saturace kyslíkem pomocí pulzní oxymetrie (SPO2, pulzní oxymetr) a krevního tlaku (MABP, automatizovaný fyziologický monitor). . Hemodynamické parametry budou průběžně měřeny pomocí prstové pletysmografie. Inspirační a exspirační plyny budou měřeny analyzátorem plynů a respirační průtok bude stanoven vyhřívaným pneumotachometrem.

Hypoxie Hypoxie bude použita k vyvolání cerebrální vazodilatace v klidových, pololežících podmínkách. Během studijní návštěvy budou provedeny tři studie isokapnické hypoxie. Subjekty budou inspirovat prostřednictvím dvoucestného ventilu bez opětovného vdechování, připojeného k směšovači plynu, dodávaného stlačeným kyslíkem (O2), oxidem uhličitým (CO2) a dusíkem (N2) pro lékařské účely. Po 3 minutách základního dýchání vzduchu v místnosti se zavede hypoxie snížením vdechovaného O2 (~11 % O2), aby se vyvolalo a udrželo 3 minuty SPO2~80 %, jak je stanoveno pulzním oxymetrem. Po 3 minutách základní hypoxie v ustáleném stavu bude následovat 5 minutová perioda podávání léku (L-NMMA, ketoroloc nebo kyselina askorbová), po které bude následovat 5 minutová udržovací perioda léku. Během této doby bude hypoxie udržována s celkovým trváním hypoxie ~15 minut na každou hypoxickou zkoušku. Izokapnie bude dosaženo přidáním CO2 do inspirovaného plynu. Ukázalo se, že end-tidal CO2 (PETCO2) je platným prediktorem hladin CO2 v arteriální krvi. Předchozí údaje z naší laboratoře ukazují, že ustáleného stavu hypoxie je dosaženo do 3 minut. Navíc bude vyšetřena hypoxie vyvolávající SPO2~80 %, protože mozkové cévy mají relativně nízkou cerebrovaskulární citlivost na méně závažnou hypoxii (SPO2~90 %). Během jedné studijní návštěvy budou provedeny celkem 3 hypoxické studie, které poskytují ~45 minut hypoxie v ustáleném stavu.

Hyperkapnie Zvýšení systémového CO2 je silným signálem pro zvýšení průtoku krve v mozkovém oběhu. Během každé studijní návštěvy budou provedeny celkem 4 hyperkapnické studie. Subjekty budou inspirovat prostřednictvím třícestného posuvného ventilu pro opětovné dýchání připojeného k latexovému balónku obsahujícímu hyperoxickou (O2=40%), hyperkapnickou (CO2=3%) směs plynu se zbytkem N2. Balónek se naplní na objem přesahující odhadovanou vitální kapacitu (určenou podle věku, pohlaví a výšky) o 1 litr. Po 3 minutách základního dýchání vzduchu v místnosti začne hyperkapnie posunutím třícestného ventilu pro opětovné dýchání ze vzduchu v místnosti do připojeného latexového balónku. Během hyperkapnie se PETCO2 zvyšuje (~10 mmHg nad výchozí hodnoty), ale vdechovaný O2 neklesne pod procento vzduchu v místnosti 21 %. Hyperkapnie bude trvat (~2 minuty), dokud hodnoty PETCO2 nedosáhnou ~10 mmHg nad základními hodnotami, poté subjekt začne dýchat vzduch v místnosti. PETCO2 bude použito jako spolehlivé, neinvazivní měření arteriálního CO2. Během jedné studijní návštěvy budou provedeny celkem 4 hyperkapnické studie poskytující ~ 8 minut hyperkapnie na studijní návštěvu.

Intravenózní katétr Vyškolený laboratorní personál umístí dva intravenózní katétry (jeden do každé paže) pro každou studijní návštěvu. Jeden katétr bude použit pro intravenózní infuzi studovaných léků (L-NMMA, Ketorolac a Askorbová kyselina). Druhý katétr bude použit k odběru přerušovaných krevních vzorků v 8 specifických časových bodech během každé studijní návštěvy, aby se zajistila farmaceutická účinnost a zkoumaly se systémové fyziologické krevní proměnné, které jsou předmětem zájmu. Katétr používaný pro odběry krve bude udržován v průchodnosti kapáním 0,9% fyziologickým roztokem. Pokud lze zavést pouze jeden IV katétr nebo jeden selže, studie bude pokračovat jak s infuzí léku, tak s odběry krve z jednoho katétru.

Intravenózní infuze L-NMMA Intravenózní L-NMMA je jediný lék neschválený FDA, který se bude používat, ale běžně se používá ve výzkumném prostředí. Intravenózní infuze L-NMMA bude použita k inhibici enzymu NOS, který je zodpovědný za tvorbu NO. L-NMMA je lyofilizovaný prášek, který se ředí fyziologickým roztokem. V současné studii bude intravenózní L-NMMA podáván prostřednictvím nasycovací dávky 3 mg kg-1 po dobu 5 minut (36 mg kg-1 h-1), po které bude následovat udržovací dávka 1 mg kg-1 h-1 po zbytek studia. Vzhledem k typickému 75 kg jedinci to povede k nasycovací dávce 225 mg a udržovací dávce (~112 minut) 140 mg v celkové výši 365 mg L-NMMA po celou dobu trvání studie, když je L-NMMA prvním studovaným lékem podávaným infuzí (L -NMMA infundovaný během HX1, HX2, HX3 a HC2, HC3, HC4). Během návštěvy, kdy je L-NMMA podán infuzí druhým lékem ze studie (L-NMMA infuzí během HX2, HX3 a HC3, HC4), bude celková dávka nižší, protože udržovací infuze (~67 min) se zkrátí o ~45 minut, celkem 309 mg L-NMMA. Nasycovací dávka L-NMMA je ekvivalentní dávce použité v předchozí studii zkoumající příspěvek NOS k hypoxické cerebrální vazodilataci, zatímco udržovací dávka a absolutní množství podaného L-NMMA bude nižší než dříve.

Intravenózní infuze Ketorolac Intravenózní ketorolac je nesteroidní protizánětlivé léčivo schválené FDA používané k léčbě bolesti. Ketorolac bude použit k nespecifické inhibici enzymu cyklooxygenázy, který je zodpovědný za tvorbu vazoaktivních prostaglandinů (prostacyklin, tromboxan). Inhibice syntézy prostaglandinů během hypoxie umožní posoudit příspěvek těchto vazoaktivních prostaglandinů k hypoxické vazodilataci. Běžné intravenózní dávky ketorolaku jsou 15 mg a 30 mg bolusové infuze; ketorolak však bude dávkován v poměru k tělesné hmotnosti. Ketorolac bude podáván intravenózně prostřednictvím nasycovací dávky 0,3 mg kg-1 po dobu 5 minut (3,6 mg kg-1 h-1) s minimální nasycovací dávkou 15 mg. Poté bude následovat udržovací dávka 0,03 mg kg-1 hod-1 po zbytek studie. Vzhledem k typickému jedinci o hmotnosti 75 kg to povede k nasycovací dávce 22,5 mg a udržovací dávce (~112 minut) 4,2 mg v celkové výši 26,7 mg ketorolaku po celou dobu trvání studie, když je ketorolak prvním studovaným lékem podávaným v infuzi (ketorolak podávaný během HX1, HX2, HX3 a HC2, HC3, HC4). Během návštěvy, kdy je ketorolak v infuzi druhého léku ze studie, ketorolac podávaný v infuzi během HX2, HX3 a HC3, HC4) bude celková dávka nižší, protože udržovací infuze (~67 min) bude snížena o ~45 minut na celkovou dávku 25 mg ketorolaku. Bylo prokázáno, že podobné dávky ketorolaku snižují prostanoidy celého těla a snižují perioperační bolest. Plazmatické koncentrace ketorolaku vrcholí během ~3 minut po intravenózním podání s konečným poločasem 5,6 hodiny.

Intravenózní infuze kyseliny askorbové Intravenózní infuze kyseliny askorbové je schválena FDA. K akutnímu snížení ROS bude intravenózně podávána kyselina askorbová. Kyselina askorbová bude podávána v nasycovací dávce 0,035 g kg beztukové hmoty-1 po dobu 5 minut (0,42 g kg beztukové hmoty-1 h-1). Následovala udržovací dávka 0,060 g kg hmoty bez tuku-1 h-1 během zbývajícího časového průběhu studie (~20 minut) pro pokračující potlačení reaktivních forem kyslíku. Vezmeme-li v úvahu jedince o hmotnosti 75 kg s hmotností beztukové tkáně ~55 kg (na základě předchozích mladých, zdravých subjektů v naší laboratoři), subjekty obdrží během studijní návštěvy ~ 3,025 g kyseliny askorbové.

Plazmové testy

Během screeningové návštěvy bude odebráno ~10 ml krve jako součást způsobilosti ke studii. Screeningové vzorky krve budou analyzovány na glykémii nalačno, kreatinin, celkový cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholesterol a triglyceridy. Vzorky žilní krve budou odebírány v 8 časových bodech během protokolu studie pomocí žilního katetru. Každý odběr krve bude 10 ml, celkem 80 ml. Krev bude centrifugována s odebranou plazmou a sérem a skladována při -80ºC. Účinnost inhibice COX bude stanovena měřením (EIA) cirkulujících metabolitů COX 6-keto-prostaglandinu F1α (jako stabilního markeru PGI2) a tromboxanu B2 (stabilního markeru TXA2). Účinnost inhibice ROS bude určena koncentracemi vitaminu C v plazmě a oxidovanými lipoproteiny s nízkou hustotou (oxLDL), které slouží jako systémový marker oxidačního stresu. Bylo prokázáno, že akutní intravenózní podání kyseliny askorbové snižuje oxLDL u zdravých dospělých. Účinnost inhibice NOS bude určena součtem dusitanů a dusičnanů (NOx), který je považován za index produkce NO.