Autológ csontvelőből származó őssejtek vizsgálata gyermekkori szívelégtelenségben

Ez a kísérleti tanulmány randomizált, keresztezett, placebo-kontrollos felépítésű. A protokoll fejlesztése során a Consolidated Standards of Reporting Trials (CONSORT) nyilatkozatot használták. A projekt etikai jóváhagyását 2008 áprilisában kapta meg.

Elkészült a CONSORT folyamatábra, és elkészítették a keresztirányú tanulmány projekttervét. Bár a vizsgálat elsődleges végpontja a biztonság és a megvalósíthatóság volt, a vizsgáló másodlagos végpontként a funkcionális eredményt kívánta vizsgálni. A rendelkezésre álló irodalom statisztikai áttekintése szerint a mágneses rezonancia képalkotással (MRI) mért ejekciós frakció (EF) 3%-os változása jelentős változást jelentene, és a számítások szerint 10 beteg elegendő lenne az EF átlagos változásának kimutatásához, feltételezve, hogy az SD 3%-os különbség 80%-os teljesítménnyel és 5%-os szignifikancia mellett. Minden számításnál azt feltételeztük, hogy a különbségek eloszlása ​​normális. A keresztezési vizsgálat mintanagyságának kiszámításához meg kellett határozni a kimutatandó minimális különbséget.

A vizsgálat időpontjában 1 és 16 év közötti gyermekek, akik vagy a Great Ormond Street Hospital (GOSH) szívelégtelenség klinikáján járnak, vagy a GOSH-ba szívelégtelenségük kezelésére és kezelésére utalják be, meghívást kapnak a vizsgálatba. Az alsó korhatárt úgy választották ki, hogy a koszorúér katéterezést a páciens méretének figyelembevételével megvalósítható legyen.

A felvételkor minden beteg szisztolés funkciója károsodott, amit az echocardiogramon a csökkent frakció határozza meg (több mint 2 SD-vel a normál alatt). A toborzott betegek funkcionális státusza a NYHA vagy Ross osztályozás szerint 2-4 osztályba sorolható.

A kizárási kritériumok közé tartozott a nagyfokú függőségi vagy intenzív ellátás és a veleszületett szívbetegség, a vírusfertőzés, amely kizárja a kórházi sejtterápiás laboratóriumok igénybevételét, az aktív rosszindulatú daganatok és az instabil szívgyógyszeres terápia.

A potenciális betegeket esetleírások alapján azonosítják, majd telefonon vagy a klinikai áttekintést követően felkeresik őket és családjukat, hogy értékeljék részvételi érdeklődésüket. A vizsgálatban való részvétel iránt érdeklődő betegek életkorának és nyelvének megfelelő írásos tájékoztatást kapnak; és egy elérhetőségi telefonszámot is megadtak, hogy szükség esetén további információkkal szolgálhassanak. Minden család lehetőséget kap arra, hogy megvitassa a vizsgálatot a kutatócsoporttal, mielőtt beleegyezik a felvételbe.

Jegyzőkönyv:

Tíz olyan beteget vesznek fel ebbe a vizsgálatba, akik megfeleltek a jogosultsági kritériumoknak. A vizsgálatba való belépéskor minden beteget véletlenszerűen besorolnak annak megállapítására, hogy kapnak-e őssejteket a protokoll első vagy második periódusában. A véletlenszerűsítést számítógéppel generált véletlenszám-táblázat, Graph pad segítségével végeztük.

A toborzást és a randomizálást követően a betegek egyéni felvételi időrendjét tervezik. Azokat a betegeket, akiknek az első vizsgálati felvételükkor őssejteket kell kapniuk, az ezt megelőző 28 napon belül felülvizsgálják. Ezen a felülvizsgálaton a kórházi sejtterápiás laboratóriumunk protokollja szerint fertőzésszűrést végeznek (beleértve a HIV-t és a hepatitis B-t és C-t is), teljes írásos beleegyezést követően.

Az eljárás napján a páciens a kardiológiai nappali gondozási intézménybe kerül kiindulási megfigyelések és klinikai értékelés céljából. A vizsgálati eljárást a szív MRI-szobában végzik el általános érzéstelenítés mellett. Az érzéstelenítéskor vérmintákat vesznek rutinvizsgálat céljából (teljes vérkép, karbamid, elektrolitok, májfunkció és NTproBNP).

Azok a betegek, akik ezen a felvételen intrakoronáris őssejteket kaptak, 20 ml csontvelőt szívtak le a hátsó csípőtaréjból aszeptikus körülmények között, közvetlenül az érzéstelenítés beindítása után.

Csontvelő-aspirációs technika:

Az antikoaguláns kezelésben részesülő betegeket minden beavatkozás és felvétel előtt kiemelték, és a csontvelő-aspiráció előtt, alatt és azt követően optimális koaguláció-kezelést hajtanak végre. Minden csontvelő-feldolgozást a Great Ormond Street Hospital sejtterápiás feldolgozó létesítményében végeznek.

Az érzéstelenítés bevezetése és a stabil légutak biztosítása után a pácienst úgy kell elhelyezni, hogy lehetővé tegye a csontvelő-szívást. Az eljárás során teljes aszeptikus feltételeket kell betartani. Egyetlen tűszúrási helyről 20 ml csontvelőt szívunk le heparinizált 10 ml-es fecskendőkkel, amelyeket a központi trokár eltávolítása után a csontvelő-tűhöz csatlakoztattak. A leszívott csontvelőt steril, heparinizált univerzális mintapalackokba helyezzük. Közvetlenül az aspiráció után a csontvelő-mintát a sejtterápiás laboratóriumba visszük mononukleáris sejtek szétválasztására standard gradiens centrifugálási technikák alkalmazásával.

A mononukleáris sejtszétválasztási protokoll körülbelül 90 percet vesz igénybe. A csontvelő-mintát úgy dolgozzák fel, hogy 1 ml-t biztosítsanak a szívkoszorúér-injekcióhoz, és 1 ml-t kriogén módon lefagyasztják a későbbi további fenotípusos elemzéshez. Az őssejt-szuszpenzió egy kis aliquot részét elemzik, hogy megkapjuk a teljes mononukleáris sejtszámot milliliterenként. Ez a sejtszám a koszorúér-katéterrel injektált mononukleáris sejtek teljes számát jelenti. Ezenkívül a sejtek életképességét is értékeltük.

Amíg az előkészített őssejtekre várunk, a szív MRI-vizsgálatot légzésvisszatartási protokoll segítségével végezzük a képalkotáshoz. Az MRI vizsgálatot követően a páciens a gépesített tolóasztal segítségével visszakerül az angiográfiás egységbe.

Az angiográfiás osztályba visszatérve a pácienst általános érzéstelenítésben tartják, amíg az őssejtlaboratórium nem értesíti, hogy az őssejt-feldolgozás a végéhez közeledik. Az őssejt-laboratóriummal való érintkezést követően egy artériás hüvelyt helyeznek a vizsgálati beteg femorális artériájába, és addig tolják előre, amíg a csúcsa a bal fő koszorúér artériába kerül. A koszorúér részleges elzáródását figyelték meg, amit az ST szegmens változásai mutatnak, és az ilyen eljárások során a nyomásnyom csillapítását rutinszerűen monitorozzák. Az 1 ml-es térfogatot lassan injektálják a koszorúér katéteren keresztül a bal fő koszorúér artériába, majd 1 ml 0,9%-os sóoldatot öblítenek le 2 percen keresztül.

Az őssejt-szuszpenzió intracoronáris injekcióját követően a szívkatétert eltávolítják, és a vérzéscsillapítást a bőrbejutási helyen érik el. Ezután a pácienst felébresztik, és a szokásos módon felépülnek.

A betegek egy éjszakán át a kardiológiai osztályra kerülnek az artériás katéterezés elérési helyének és a csontvelő aspirációs helyének rutinszerű monitorozásával; a szívápolási megfigyelések mindvégig folytatódnak. A betegeket másnap hazaengedik, és az eljárást követő három hónapon belül a járóbeteg-klinikán választhatóan felülvizsgálják őket, vagy javasolják, hogy aggályok esetén mielőbb lépjenek kapcsolatba a kutatóval.

A beavatkozások keresztezése hat hónap elteltével történik, a második alkalommal az őssejt-csoport placebót kap szívkatéterezésen keresztül (a vizsgálat placebo ágához nincs szükség csontvelő-gyűjtésre). Ugyanaz a befogadás, megfigyelés és nyomon követés történik, mint a vizsgálat őssejt szakaszában. Az intrakoronáris injekcióhoz használt placebó 1 ml 0,9%-os sóoldat, ami összhangban van a felnőtteknél végzett vizsgálatokban használt placebo oldattal. Az 1 ml placebót 1 ml 0,9%-os sóoldat követi a vizsgálat őssejt ágával való korreláció érdekében. A beavatkozás után három hónappal egy időközi klinikai felülvizsgálatra, hat hónap elteltével pedig egy nyomon követési szív MRI vizsgálatra kerül sor. Az időskálát a rendelkezésre álló felnőtt szakirodalom áttekintése után választották ki, amely azt mutatta, hogy a bal kamrára gyakorolt ​​hatások általában 6 hónapon belül jelentkeztek.

Azok a betegek, akik véletlenszerűen placebót kaptak a vizsgálat első szakaszában, átmentek, hogy a második szakaszban őssejteket kapjanak. Az időközi és a végső nyomon követési intézkedések megegyeznek az őssejt- és a placebocsoporttal.

Az érzéstelenítést minden betegnél szabványosították, és minden eljáráshoz ugyanazt az aneszteziológust alkalmazták. A csontvelő-előkészítést is szabványosították, és minden esetben ugyanaz a tudós végezte. A számítógépes adatbevitelt kétszer ellenőrzik. A betegazonosítókat eltávolítják az anonim képekről, hogy később vakelemzést lehessen végezni; ily módon elfogulatlan képelemzés történik. Az Osirix szoftvert használó egyetlen kutató végzi az adatok off-line elemzését. Ezen adatok második ellenőrzéseként a kutató eredményeit egy második analizátor értékeli ki, ismét vakon a betegazonosítók számára. Az MRI adatok vakításának kulcsát egy olyan klinikus dolgozza ki, alkalmazza és biztonságosan tárolja, aki egyébként nem vesz részt a vizsgálatban. Az indexelt értékek korrigálják az adatokat az életkor, a nem, a magasság és a testsúly tekintetében, és lehetővé teszik az azonos egyeden végzett vizsgálatsorozatok és a különböző egyének közötti valós összehasonlítást.

Elsődleges eredménymérések:

Az elsődleges kimeneti mérőszám a haláltól és a transzplantációtól való mentesség, illetve a csontvelő-injekcióval vagy érzéstelenítéssel összefüggő bármilyen szövődmény (fertőzés/rosszindulatú daganat/anafilaxia/vesekárosodás) volt. Létrejön egy biztonsági ellenőrző bizottság, amely magában foglalja a Great Ormond Street Kórház egy, a vizsgálatban nem érintett kardiológusát, egy külső kardiológust és egy laikus képviselőt. Bármilyen nemkívánatos eseményt jelenteni kell a bizottságnak, amely jogosult a vizsgálatot bármikor leállítani, ha aggályok merülnek fel.

Másodlagos eredménymérések:

Az ejekciós frakció, a bal kamra térfogata és tömege a szív MRI-ből származik. Vért vesznek NT proBNP-re. Ezenkívül a funkcionális állapotot a New York Heart Association osztályozása vagy a Ross osztályozás alapján értékelik fiatalabb gyermekeknél.

Minden betegnél általános érzéstelenítés alatt szív MRI-t végeznek. Az aneszteziológus és az érzéstelenítési protokoll minden beteg számára azonos.

Minden kép egy 1,5-T MR szkennerrel (Avanto, Siemens, Erlangen, Németország) készült, 12 elemes fázissoros tekercset használva a jelek vételére és a testtekercset a jelátvitelre. A szívkapuzáshoz vektor-EKG-rendszert használnak.

A bal kamra (LV) térfogatát összefüggő, rövid tengelyű, egyensúlyi állapotú szabad precessziós képből mérjük, amely mindkét kamrát lefedi (7-13 szelet, a gyermek méretétől függően). Mindegyik szelet egyetlen 10-15 másodperces lélegzetvisszatartással történik, a korábban leírtak szerint. Minden képfeldolgozás a nyílt forráskódú Osirix DICOM (digitális képalkotás és kommunikáció az orvostudományban) szoftver házon belüli beépülő moduljaival történik. Az LV végdiasztolés térfogatát (EDV) és end-systolés térfogatát (ESV) az endokardiális határok kézi szegmentálásával mérjük a rövid tengelyű adatokban. A mitrális billentyű körülhatárolásával kapcsolatos problémák kiküszöbölése érdekében a bazális szeletek gondos szegmentálását a 4-kamrás és LV hosszútengelyes nézetekkel együtt hajtják végre. A kamrai stroke volumen (SV) az EDV és az ESV közötti különbség, a kamrai ejekciós frakció (%) pedig (SV/EDV) × 100 volt.

Mindegyik másodlagos végpont, az EDV, ESV és EF esetében a kezelések összehasonlítása a kezelési szándék alapján történik. A kezelés utáni intézkedések keresztezett elemzése variancia-modell segítségével történik, figyelembe véve a sorrendet, az időszakot és a kezelési hatásokat. Először az átviteli hatást tesztelik, és ahol nincs bizonyíték szignifikáns hatásra, a kezelés hatását tesztelik. Ezt követően egy általánosított becslési egyenlet (GEE) modellt illesztettünk, amely lehetővé tette az alapértékek kiigazítását.

Ahol az adatok eloszlása ​​egyértelműen nem volt normális, a vizsgálók logaritmikus transzformációt alkalmaznak. A Stata-t minden statisztikai elemzéshez használjuk, és minden teszt kétoldalas volt. A 0,05 alatti P értéket szignifikánsnak tekintettük.