Zkouška autologních kmenových buněk odvozených z kostní dřeně u dětského srdečního selhání

Tato pilotní studie má randomizovaný, zkřížený, placebem kontrolovaný design. Jako vodítko pro vývoj protokolu bylo použito prohlášení Consolidated Standards of Reporting Trials (CONSORT). Etický souhlas byl pro tento projekt získán v dubnu 2008.

Byl vytvořen vývojový diagram CONSORT a navržen projektový plán pro křížovou studii. Ačkoli primárním koncovým bodem studie byla bezpečnost a proveditelnost, výzkumník se zaměřil na funkční výsledek jako na sekundární cílový bod. Statistický přehled dostupné literatury ukázal, že 3% změna ejekční frakce (EF) měřená zobrazením magnetickou rezonancí (MRI) by představovala významnou změnu a vypočítaných 10 pacientů by postačovalo k detekci této průměrné změny EF za předpokladu SD rozdíl 3% s 80% silou a 5% významností. U všech výpočtů se předpokládalo, že rozložení rozdílů bylo normální. Výpočet velikosti vzorku pro křížovou studii vyžadoval definici minimálního rozdílu, který má být detekován.

K účasti ve studii budou pozvány děti ve věku od 1 roku do 16 let při kontrole, které buď navštěvují kliniku srdečního selhání v nemocnici Great Ormond Street Hospital (GOSH) nebo jsou doporučeny k přijetí a léčbě jejich srdečního selhání na GOSH. Spodní věková hranice byla zvolena tak, aby bylo možné provést katetrizaci koronárních tepen s ohledem na velikost pacienta.

Při náboru mají všichni pacienti zhoršenou systolickou funkci, jak bylo zjištěno sníženou frakcí zkrácení na echokardiogramu (více než 2 SD pod normou). Funkční stav rekrutovaných pacientů byl třída 2-4, jak je definováno NYHA nebo Rossovou klasifikací.

Kritéria vyloučení byla potřeba vysoké závislosti nebo intenzivní péče a vrozená srdeční vada, virová infekce, která by vylučovala použití nemocničních zařízení Laboratoře buněčné terapie, aktivní malignita a nestabilní srdeční farmakoterapie.

Potenciální pacienti budou identifikováni z kazuistik a oni a jejich rodiny osloví buď telefonicky, nebo na základě klinického hodnocení, aby zhodnotili svůj zájem o účast. Všichni pacienti, kteří projevili zájem o účast ve studii, obdrží písemné informace odpovídající věku a jazyku; a také uvedení kontaktních telefonních čísel, aby bylo možné v případě potřeby poskytnout další informace. Každá rodina dostane příležitost prodiskutovat studii s výzkumným týmem před získáním souhlasu se zařazením.

Protokol:

Do této studie bude vybráno deset pacientů, kteří splnili kritéria způsobilosti. Každý pacient je při vstupu do studie randomizován, aby se určilo, zda obdrží kmenové buňky v prvním nebo druhém období protokolu. Randomizace byla provedena pomocí počítačem generované tabulky náhodných čísel, Graph pad.

Po náboru a randomizaci mají pacienti plánovanou individuální časovou osu přijetí. Ti pacienti, kteří mají dostat kmenové buňky při svém prvním přijetí do studie, jsou kontrolováni během 28 dnů před tímto datem. Při této kontrole bude po úplném písemném souhlasu proveden screening infekce podle protokolu naší nemocniční Laboratoře buněčné terapie (včetně HIV a hepatitidy B a C).

V den výkonu bude pacient přijat do zařízení denní péče o srdce pro základní pozorování a klinické hodnocení. Postup studie bude proveden na sále MRI srdce v celkové anestezii. Krevní vzorky budou odebrány v době anestezie pro rutinní vyšetření (plný krevní obraz, močovina, elektrolyty, jaterní funkce a NTproBNP).

Těm pacientům, kteří při tomto příjmu dostávají intrakoronární kmenové buňky, bylo ihned po úvodu do anestezie odsáto 20 ml kostní dřeně ze zadního kyčelního hřebene za aseptických podmínek.

Technika odsávání kostní dřeně:

Tito pacienti na antikoagulační léčbě jsou předem upozorněni na všechny procedury a přijetí a před, během a po aspiraci kostní dřeně je zavedena optimální koagulační léčba. Veškeré zpracování kostní dřeně se provádí v zařízení na zpracování buněčné terapie nemocnice Great Ormond Street Hospital.

Po indukci anestezie a zajištění stabilních dýchacích cest je pacient umístěn tak, aby umožnil aspiraci kostní dřeně. Během celého postupu jsou dodržovány plně aseptické podmínky. Objem 20 ml kostní dřeně se odsaje z jednoho místa vpichu jehlou pomocí heparinizovaných 10ml injekčních stříkaček připojených k jehle kostní dřeně po odstranění centrálního trokaru. Odsátá kostní dřeň se přenese do sterilních heparinizovaných univerzálních lahví na vzorky. Ihned po odsátí je vzorek kostní dřeně odebrán do laboratoře buněčné terapie k separaci mononukleárních buněk pomocí standardních technik gradientové centrifugace.

Dokončení protokolu separace mononukleárních buněk trvá přibližně 90 minut. Vzorek kostní dřeně se zpracuje tak, aby poskytl 1 ml pro intrakoronární injekci a 1 ml byl kryogenně zmražen pro další fenotypovou analýzu později. Malý alikvot suspenze kmenových buněk se analyzuje, aby se získal celkový počet mononukleárních buněk na mililitr. Tento počet buněk představuje celkový počet mononukleárních buněk injikovaných intrakoronární katetrizací. Kromě toho byla také hodnocena životaschopnost buněk.

Během čekání na připravené kmenové buňky se provádí MRI vyšetření srdce pomocí protokolu zadržení dechu pro získání obrazu. Po vyšetření magnetickou rezonancí je pacient přemístěn pomocí mechanizovaného posuvného stolu zpět do angiografického pracoviště.

Po návratu do angiografického pracoviště je pacient udržován v celkové anestezii, dokud laboratoř kmenových buněk neoznámí, že zpracování kmenových buněk se blíží ke konci. Po kontaktu s laboratoří kmenových buněk se arteriální pouzdro umístí do femorální arterie studovaného pacienta a posune se, dokud se jeho hrot nedostane do levé hlavní koronární arterie. Byla pozorována částečná okluze koronární arterie, jak bylo prokázáno změnami segmentu ST a tlumení tlakové stopy je během těchto postupů rutinně monitorováno. Objem 1 ml je pomalu injikován katetrem koronární artérie do levé hlavní koronární arterie a následně propláchnut 1 ml 0,9% fyziologickým roztokem po dobu 2 minut.

Po intrakoronární injekci suspenze kmenových buněk se srdeční katétr odstraní a dosáhne se hemostázy v místě vstupu do kůže. Pacient je poté probuzen a zotaven standardním způsobem.

Pacienti jsou přijímáni na srdeční oddělení přes noc s rutinním monitorováním místa přístupu k arteriální katetrizaci a místa aspirace kostní dřeně; pozorování péče o srdce pokračují po celou dobu. Pacienti jsou propuštěni následující den a elektivně vyšetřeni v ambulanci tři měsíce po zákroku nebo jim je doporučeno, aby v případě obav kontaktovali výzkumného pracovníka dříve.

Ke zkřížení intervencí dochází po šesti měsících u skupiny kmenových buněk, která dostávala placebo prostřednictvím srdeční katetrizace (pro placebo větev studie není vyžadován žádný odběr kostní dřeně) při druhé příležitosti. Bude zajištěno stejné přijetí, sledování a sledování jako u stadia kmenových buněk studie. Placebem použitým pro intrakoronární injekci je 1 ml 0,9% fyziologického roztoku, což je v souladu s roztokem placeba používaným ve studiích u dospělých. Po 1 ml placeba následuje propláchnutí 1 ml 0,9% fyziologickým roztokem pro korelaci s kmenovými buňkami studie. Předběžná klinická revize je opět uspořádána tři měsíce po výkonu a kontrolní vyšetření srdce MRI po šesti měsících. Časová škála byla zvolena po přezkoumání dostupné literatury pro dospělé, která ukázala, že účinky na levou komoru byly obvykle pozorovány do 6 měsíců.

Tito pacienti náhodně přidělili placebo v první fázi studie, aby dostali kmenové buňky ve fázi dvě. Dočasná a konečná následná opatření jsou stejná pro skupiny s kmenovými buňkami a placebo.

Anestezie byla standardizována pro všechny pacienty a u všech výkonů byl použit stejný anesteziolog. Příprava kostní dřeně byla také standardizována a v každém případě ji provedl stejný vědec. Zadávání dat z počítače bude dvakrát zkontrolováno. Identifikátory pacientů jsou z anonymních snímků odstraněny, aby bylo možné později provést slepou analýzu; tímto způsobem se provádí nezaujatá analýza obrazu. Jeden výzkumník používající software Osirix provádí off-line analýzu dat. Jako druhá kontrola těchto dat jsou výsledky výzkumníka vyhodnoceny, opět slepé k identifikátorům pacientů, druhým analyzátorem. Klíč k zaslepení dat MRI je navržen, aplikován a bezpečně uložen klinikem, který se jinak do studie nezapojil. Indexované hodnoty opravují údaje o věku, pohlaví, výšce a hmotnosti a umožňují provádět pravdivá srovnání mezi sériemi studií stejného jedince a mezi různými jednotlivci.

Primární měřítka výsledku:

Primárním výsledným měřítkem byla absence úmrtí a transplantace nebo jakékoli komplikace, které by mohly být považovány za související s injekcí kostní dřeně nebo anestezií (infekce/malignita/anafylaxe/zhoršení ledvin). Bude zřízena bezpečnostní monitorovací komise, včetně kardiologa z nemocnice Great Ormond Street, který se studie nezapojil, externího kardiologa a laického zástupce. Jakékoli nežádoucí příhody budou hlášeny komisi, která byla zmocněna kdykoli zastavit pokus, pokud se objeví obavy.

Sekundární výsledná opatření:

Ejekční frakce, objemy levé komory a hmota jsou odvozeny z MRI srdce. Odebírá se krev na NT proBNP. Funkční stav je navíc hodnocen klasifikací New York Heart Association nebo Rossovou klasifikací u mladších dětí.

Každý pacient má srdeční MRI v celkové anestezii. Anesteziolog a anesteziologický protokol jsou pro všechny pacienty stejné.

Všechny snímky jsou získány 1,5-T MR skenerem (Avanto, Siemens, Erlangen, Německo) s použitím 12-prvkové cívky s fázovým polem pro příjem signálu a tělové cívky pro přenos signálu. Pro srdeční hradlování se používá vektorový EKG systém.

Objemy levé komory (LV) jsou měřeny ze souvislého precesního filmu v ustáleném stavu s krátkou osou pokrývající obě komory (7-13 řezů, v závislosti na velikosti dítěte). Každý řez je pořízen v jediném 10- až 15sekundovém zadržení dechu, jak bylo popsáno výše. Veškeré zpracování obrazu se provádí pomocí vlastních zásuvných modulů pro open-source software Osirix DICOM (digital imaging and communications in medicine). End-diastolický objem LK (EDV) a end-systolický objem (ESV) se měří manuální segmentací endokardiálních hranic v datech na krátké ose. K překonání problémů s vymezením mitrální chlopně se provádí pečlivá segmentace bazálních řezů ve spojení se 4-komorovým a LV pohledem v dlouhé ose. Komorový zdvihový objem (SV) byl rozdíl mezi EDV a ESV a ventrikulární ejekční frakce (%) byla (SV/EDV) × 100.

Pro každý ze sekundárních koncových bodů, EDV, ESV a EF, se provádějí srovnání mezi léčbami na základě záměru léčit. Křížová analýza opatření po léčbě se provádí pomocí analýzy modelu rozptylu, přičemž se bere v úvahu sekvence, období a účinky léčby. Nejprve se testuje přenosový efekt a tam, kde není prokázán významný efekt, se testuje efekt léčby. Následný model zobecněné odhadovací rovnice (GEE) byl sestaven, což umožnilo úpravu pro základní měření.

Tam, kde distribuce dat byla zjevně nenormální, vyšetřovatelé použili logaritmickou transformaci. Stata se používá pro všechny statistické analýzy a všechny testy byly oboustranné. Hodnota P < 0,05 byla považována za významnou.